今天给大家分享一篇最近发表在Bio{attr}3229{/attr}njugate Chem.上的研究进展，题为：Rapid, High-Yielding Solid-Phase Synthesis of Cathepsin‑B Cleavable Linkers for Targeted Cancer Therapeutics.文章的通讯作者是英属哥伦比亚大学的David M. Perrin教授。

抗体偶联药物（antibody drug conjugate, ADC）作为新型“生物导弹药物”，是将肿瘤杀伤力极强的小分子毒素药物与单克隆抗体通过连接子偶联，得到的偶联物利用单抗的靶向性实现肿瘤部位的选择性药物递送。ADC开发的关键之一是在血液循环中具有良好稳定性的连接子，该连接子旨在在靶细胞内发生分解，从而释放出高毒性药物。其中，采用缬氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）这种可被溶酶体内的组织蛋白酶B（Cathepsin B）裂解的连接子的ADC药物，已有三款被FDA批准使用。这三款ADC药物的商业名分别是（Adcetris, Padcev, 和Polivy）（图1）。

图1. 被FDA批准使用的三款ADC结构。连接子结构含Val-Cit结构。

传统的合成Val-Cit连接子的方法主要有四种，两种是液相合成（图2），两种是固相合成（图3）。液相方法在瓜氨酸的α-碳处容易发生差向异构化，并且反应步骤需要多次涉及NHS酯的活化和保护基相关的操作。作者指出瓜氨酸的脲基侧链的存在大大降低了在极性有机溶剂（例如乙腈、甲醇和二氯甲烷）中的溶解度，对色谱分离和后续分析造成了困难。

图2. Val-Cit连接子的两种液相合成方法。

相比之下，Fmoc固相肽合成（SPPS）方法具有自动化，收率高，成本低以及快速性等优势。但是，传统的固相法也存在一些难点。如图3所示，将编号为12的“N-Fmoc-Cit-对氨基苯甲醇”往树脂上锚定时存在难度，即伯醇类化合物常遇到此类问题。若将“N-Fmoc-Cit-OH”直接锚定到树脂上，总产量低于10％。

图3. Val-Cit连接子的两种固相合成方法。

基于上述合成方法存在的局限性，作者在本文提出了Val-Cit衍生的二肽和三肽连接子的简单且高产的固相合成方法。作者所报道的方法的亮点在于在Fmoc去除过程中使用Oxyma作为缓冲剂，并在偶联步骤中使用温和的DIC/Oxyma活化，这两个步骤均避免了碱的使用。

首先，作者指出按照旧方法在图4所示的尝试仅能得到低产率。作者将其归因于未保护的脲基在碱性条件下可能会攻击2-氯三苯甲基酯锚定位点的羰基，形成δ-内酰胺，并发生从树脂上自切除。因此，作者计划在整个合成过程中尽量减少使用碱，以实现高收率。作者通过文献调研指出，在脱除Fmoc的步骤中，使用含有摩尔浓度1 M的Oxyma的1：4哌啶/ DMF，最有利于缓冲哌啶。随后作者选用DIC/Oxyma的温和条件用于偶联步骤。如图5所示，将编号为16的产物收率提高至94％，与以前的SPPS方法相比，提高了10倍。

图4. 有碱条件下，树脂上的瓜氨酸发生裂解，肽链终止导致低产率。

图5. 本文所用合成Val-Cit连接子的新策略。在Fmoc去除过程中使用Oxyma来调节pH。在偶联反应过程中，DIC/Oxyma作为偶联剂。

为了进一步验证此新方法，作者还合成了另外两种与ADC药物开发息息相关的Val-Cit连接子（编号18和19），均具有高产率，其中编号为19的Glu-Val-Cit三肽连接子具有十分重要的临床应用价值（图6）。

图6. 本文所用合成Val-Cit连接子。编号18具有马来酰亚胺基团，编号19为Glu-Val-Cit三肽连接子。

总结来说，作者在本文报道了一种Val-Cit衍生的二肽和三肽连接子的简单且高产的固相合成方法。

作者：WH  审校：HYL

Perrin, D. et al., Bioconjugate Chem. 2020, 31, 2685−2690.

Link: https://dx.doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.0c00563