在有机化合物的分离中, 异构体的分离是最让人头疼的一件事！抛开对映异构体的分离（拆分）不说，一些非对映体、顺反异构体的混合物虽然理论上可以在非手性环境中分离，可实际情况中却往往让人伤透了心（不是一个物质的点，都是装纯）。如果要想拿到纯的核磁谱，怎么办？把极性往小了调？把柱子往高了装（慌的一匹）？  

（图片提供者系上海有机所博士：七点二十五分）

君莫慌！今天，小编就给大家分享一个多数人不知道的分离技术，可以专门对付极性相似的不饱和化合物：硝酸银络合法（柱色谱或萃取）。

硝酸银-柱色谱分离法

含有双键异构体的挥发油、萜类等天然产物或小分子化合物用一般色谱法难以分离，但用这种硝酸银柱色谱法可就神奇多了。 在谈原理和应用之前，让我们先看看这种分类方法的效果，以下面两个板子为例：

图1. 从右到左，AgNO3的量逐渐增多，分离越来越清晰

图2 添加AgNO3和未添加AgNO3的板子对比

怎么样？是不是很开，知道其中的原理，你定会用的游刃有余：

AgNO3中的银离子为d10型离子, 具有空的S和P轨道。SP 杂化后, 能和含有成键电子的键, 形成二配位的稳定性不同的配合物。① 当双键π电子作为供电子配体时, 与Ag 的空SP 杂化轨道重叠, 形成三中心配键; ② 当Ag作为供电子者时, 其d 轨道是全充满, 可以供电子与π反键轨道重叠, 形成三中心配键。Ag 与双键形成配合物时, 这两种键可同时形成。这种配合物的稳定性, 既受电子效应的影响, 又受空间效应的影响。

图1. I：SP 杂化与π 电子重叠；II：SP 杂化与π反键轨道重叠

太复杂，有没有什么一般规律，就知道你会这么问，小编已经帮你找到啦，一共5点：

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 在相同情况下双键数越多, 形成的配合物越牢固，难洗脱； 

1.  当有环状时，环外比环内双键者与AgNO3配合牢固；

2. 双键位置不同时，末端最牢，顺式次之，反式最不牢；

3. 银离子与多重苯环芳烃的配合物比单环的芳烃易形成；

4. 碳原子数与含双键数( 或大π键数) 之比小于或等于6 时, 则可能与Ag离子配合, 比值越小配合反应越易进行。

   
   

硝酸银硅胶的使用与正相硅胶基本相同，但需要特别注意的是要在避光！避光！避光！的情况下使用！（因为硝酸银见光易分解，银离子不稳定，容易被空气中的氧气氧化，变成黑色 ，所以一般含银的物质一般说明书上表明避光、密闭、保存；硝酸银加热至440℃时分解成银、氮气、氧气和二氧化氮。）

Ag-TLC薄层板制法:

1. 可在吸附剂中加入5~25%硝酸银水溶液代替水制成均匀糊状，再按常法铺成薄层,制成薄层避光阴干，于105℃活化半小时后避光贮存，制成的薄层以不变成灰色为好，在三天内应用。

2. 也可先把硝酸银用少量水溶解，再用甲醇稀释成10%溶液，把预先制好的硅胶G薄层浸入此溶液中约1分钟，取出避光阴干，按上法活化，贮存。

用AgNO3甲醇浸渍

天然产物分离案例

硝酸银硅胶色谱法在许多天然产物的分离中都有成功的案例，包括萜类、挥发油等许多抗癌有效成分的分离，下面介绍几例，大家可对照上述规律尝试判断洗脱顺序。

1. 半边旗中抗癌有效成分5F的分离（与4F混合），洗脱顺序5F > 4F。

图3.  半边旗中抗癌有效成分5F的分离

解析：两者母核相同，4F 无双键；5F 有一环外双键, 易与Ag形成配合物而洗脱分离。

2. 月桂油中3种不饱和化合物的分离，洗脱顺序为 III > II > I。

解析：I 为两个末端双键，吸附最牢；II为一个末端双键，吸附次之；

III无末端双键，仅环内双键，吸附最弱。

3. 植物细辛中的3种天然产物成分：α-细辛醚、β-细辛醚、欧细辛醚，用2.0%AgNO3-硅胶柱分离，苯-乙醚（5∶1）洗脱，流出先后顺序为：α-细辛醚＞β-细辛醚＞欧细辛醚。

图2.  细辛中有效成分的分离

解析：因为α-细辛醚环外双键为反式，与 AgNO3络合不牢固；β-细辛醚为顺式，与AgNO3络合能力大于α-细辛醚，而欧细辛醚为末端双键，与AgNO3络合能力最强。

硝酸银络合萃取法

除了硝酸银-柱色谱外，硝酸银络合萃取法也可以用于许多不饱和化合物的分离。

1. 鱼油中EPA ( 五个双键) 和DHA( 6 个双键) 都对人体有重要的生理活性作用，都能与Ag离子形成很稳定的亲水性配合物, 而从鱼油相中分离出来。

2. DHA 乙酯、烯丙醚、苯、油酸乙酯4 个有机物。除油酸乙酯外, 其他3 种都成功地形成配合物而转人水相中。3 种配合物稳定性为: 烯丙醚> DHA 乙酯> 苯。

解析：在没有空间位阻时, 碳原子数与含双键数( 或大二键数) 之比小于或等于6时, 则可能与Ag+ 配合, 比值越小配合反应越易进行。

常见问题

1. 硝酸银硅胶柱的制备方法？处理过程中是不是要避光，烘干时会不会发生氧化啊？

硝酸银硅胶制备：硅胶100克，浓盐酸处理,除去硅胶中的金属离子,（浓盐酸不显黄色为止）,用蒸馏水洗至中性，加入由20克硝酸银配成的水溶液,混匀,在蔽光条件下,于110度活化4小时，备用。

干法装柱：一般硝酸银溶于甲醇－水（9:1）浓度5～8％，然后在避光下拌入硅胶，全部润湿即可，晾干，可以稍微烘一下，注意避光，如果略微有点发黑也可以使用。如果没有棕色柱，可用一块黑色的厚布将普通玻璃柱包起来使用，硅胶会变黑，但只要你快点走柱，不会影响分离效果。

2. 洗脱下来的流分会不会带有硝酸银，或者得到某成分与硝酸银形成的络合物？应该怎么后处理呢？

一般硝酸银不会随被洗下，挥发油极性不大，石油醚，丙酮，乙酸乙酯没问题，我做过，甲醇－氯仿也不会洗下来。

3. 洗脱系统怎么选？

找洗脱系统可以用硝酸银硅胶板，配好硝酸银溶液，将铺好的硅胶板润湿，晾干即可使用，尽量避光，即制即用。硝酸银柱走过后肯定要变黑，不用怕，效果还是有的！ 

总结：硝酸银络合法( 萃取或色谱法) 可以帮助结构和物理化学性质相近、用普通色谱法或萃取法难以奏效的双键化合物的分离，在医药界已经被成功运用。但也存在一些弊病：比如易混入硝酸银这一杂质, 除去略繁琐；多双键有机物具一定的还原性易将Ag+还原成Ag ;Ag+本身也不稳定, 易还原为Ag；AgNO3具腐蚀性; Ag的回收与再生问题, 因为银还是较昂贵的金属等。可否用别的金属元素代替银离子，扩大络离子的应用范围? 例如二价铜、锌等元素,  有待进一步探讨。

参考资料：

广州中医药大学学报，DOI：10.3969/j.issn.1007-3213.2004.04.023

Separations of lipids by silver ion chromatography，JOURNALO F LIPIDR ESEARCHV

丁香园， http://www.dxy.cn/bbs/topic/2756110