利用酶对蛋白质/肽进行位点特异性修饰已成为研究蛋白质/肽功能或产生治疗性结合物的一种高度可及的、广泛的方法。天冬酰胺基内切肽酶（AEPs）催化转肽基化反应（AEP连接酶），由于其催化效率和短的三肽识别基序，已成为细菌分类酶sortase A的良好替代品。然而，在标准条件下要达到理想的产率需要大量过量的亲核试剂。

近期，澳大利亚昆士兰大学Thomas Durek和David J. Craik课题组报告了一种通过选择性地淬灭竞争性亲核肽离去基团的，将AEP催化的转肽平衡转移到产物形成。迄今为止，在大肠杆菌中通过重组生产获得的最具催化功能的AEP连接酶是[C247A]OaAEP1，它是一种携带识别基序Asn-Xaa-Yaa（P1-P1'-P2'）的蛋白，其中P2'是疏水和脂肪族氨基酸（除了Val），P1'残基是小分子氨基酸（例如Gly），它可以使用比底物少200-1000倍的量并用合适的亲核肽有效负载连接对底物C末端修饰。

图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

N-末端二肽亲核序列（例如Gly-Leu）的蛋白N-末端修饰可以通过装载Asn-Gly-Leu来实现。[C247A]OaAEP1的识别序列非常严格，而对于引入的亲核序列是混杂的。AEP连接酶可以识别一种替代的亲核序列（Gly-Val），这种序列产生的产物（Asn-Gly-Val）与Asn-Gly-Leu或Asn-Gly-Ile基序相比识别率很低，从而减少了再识别概率。然而，为了首先产生这种目标产物，需要用相对于蛋白来说大量过量（>20倍）的底物Gly-Val亲核蛋白来竞争性从底物释放离去基团Gly-Leu。这说明淬灭竞争的亲核肽可以推动转肽反应完成，并提高AEP连接酶的催化能力。通过金属络合将这种潜在的亲核猝灭作用应用于[C247A]OaAEP1催化的连接反应中，Gly-Leu-His离去基团也必须是有能力的金属结合序列。因此，合成了两种模式肽(GGHGGR 和GLHGGR)，并通过核磁氢谱鉴定它们与Ni²⁺的结合能力。

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Gly-Leu-His作为金属离子络合基序，[C247A]OaAEP1催化模式底物KKGKGWTWNGLH。结果表明，当加入Ni²⁺后产物明显增加。

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接下来，试图用这种方法应用于蛋白-肽结合反应的增强。当仅使用2摩尔当量的肽探针时，所有蛋白质在Ni²⁺增强反应中都有75%的修饰。

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为了评估这种亲核猝灭方法是否能超越简单的肽或蛋白肽结合反应，从而进一步研究了折叠蛋白底物相互之间的连接。实验结果表明，该方法可以增强蛋白与蛋白间的连接，甚至有助于形成难以获得的寡蛋白产物。

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参考文献：Improved Asparaginyl-Ligase-Catalyzed Transpeptidation via SelectiveNucleophile Quenching

Angew. Chem. Int. Ed.

DOI：10.1002/anie.202013584

原文作者：Fabian B. H. Rehm+, Tristan J. Tyler+, Kuok Yap, Thomas Durek,* andDavid J. Craik*