UCLA 唐奕组JACS | 黄素依赖型卤化酶AoiQ催化脂肪碳偕二卤代反应-

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摘要

在合成和生物催化领域中,可以催化脂肪族碳的卤化酶引起了极大的兴趣。该文阐明了AoiQ反应机理,AoiQ是一种黄素依赖性卤化酶(FDH),在dichlorodiaporthin生物合成过程中,可催化1,3-二酮底物的偕二卤化反应。 AoiQ是第一个通过体外生化实验阐明能够卤化脂肪族底物的FDH 



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内容

卤代化合物的应用范围很广,当今许多最畅销的药物和农用化学品都含有卤素原子。卤代可以改善生物活性,此外,卤素化合物也是在有机合成中的重要作用。通常,诸如甲基的脂族烃的碳氢键是化学惰性的,如何区域选择型的引入卤原子是现在催化学家们的研究热点。自然界中,通常non-heme-铁依赖型的α-kg卤化酶通过自由基的机制催化惰性碳氢键卤化反应。FDH通过亲电取代机制催化芳香族卤化反应,而关于其催化碳氢键的卤化报道较少。Chankhamjon等人前期报道了一种双功能FDH-MT融合蛋白AoiQ催化orthosporin (4) 的氯化反应产生化合物1-3。化合物4氯化位点的碳氢键是惰性的,在C11生成亲核试剂有悖于传统的FDH的亲电取代机制。作者推测AoiQ通过自由基机理催化42的氯化。因此,进一步研究卤化机制十分必要。



Chankhamjon前期报道aoiQdiaporthin的生物合成基因簇aoi位于不同的染色体上。在对AoiQ的研究中,作者发现aoiQ位于另一BGCdia)中,该簇编码NRPKSdiaA),内酰胺diaB),SDR diaCFMO diaD。生物信息学分析发现dia同源簇保守存在于其他真菌中,包括dichlorodiaporthin的产生菌株,但aoi不保守。

为了验证AoiQaoidia基因簇中的功能,作者在A. nidulans中异源表达了这两个簇。当aoiGaoiF aoiQ共表达时,未观察到氯化产物,而观察到了单和二甲基化的diaporthin 化合物57。相反,当DiaADiaB aoiQ共表达时,可以观察到氯化产物1。这些结果表明, diadichlorodiaporthin的实际生物合成基因簇。由于A. nidulans也具有该簇,因此作者在酵母中进一步异源表达该簇以避免cross-talk。当表达DiaADiaB时,作者可以观察到6及其还原产物8989由内源性还原酶催化的。 6具有13-二酮部分,其可以作为dichlorodiaporthin的前体。因此,作者共表达了DiaABAoiQ,然而只能检测到痕量的1,而6被完全消耗。当共表达DiaC SDR时,可以观察到1作为主要氯化产物。因此,作者推测SDR的原本功能是还原AoiQ的催化产物。当表达DiaABC时,仅观察到C10还原的化合物8,表明DiaC区域选择性的还原C10酮羰基。



接着,作者分别体外表达了AoiQMTFDH结构域蛋白。当 AoiQ-FDHDiaC酶与底物6进行体外反应时,可以检测到卤代产物产物212,证实了二酮是AoiQ的实际底物。



由底物6转化成2需要经过氯化,脱乙酰和酮还原反应。 为了解脱酰基步骤,作者化学合成了化合物15,在体外反应缓冲液中, 15自发转化为α-卤代酮16,这表明脱乙酰基反应为非酶促反应 添加AoiQ-FDHDiaC可产生 2,这表明15为生物合成中间体。该反应可能是由水攻击 β-羰基,然后消除a-卤代羰甲基而发生的。

当作者在构巢曲霉中共表达DiaABAoiQ-FDH时,作者观察到三氯代化合物19,其中5位被氯化。这一结果表明,AoiQ-FDH还可以催化芳香族氯化反应。体外测定表明AoiQ-FDH可将 2转化为19;也可将4812分别转化为相应的C5C7氯代化合物。该结果表明二酮底物中的C11是优选的亲核试剂,二酮部分的缺失会导致其他亲核试剂的氯化。由于具有不同氯化位置的化合物的保留时间和质量相似,这可能导致是前期报导对AoiQ可作用未活化的sp3碳误解的原因。

总而言之,该文报道了单组分FDH AoiQ可催化可烯化的13-二酮底物发生偕二卤代反应,继而导致罕见聚酮缩短反应。对 AoiQ作用机制的研究对拓展其用于生物催化领域生产卤代非芳香化合物奠定了基础。

华中科技大学药学院张勇慧教授团队博士生刘梦婷为该文的第一作者。加州大学洛杉矶分校(UCLA)的Yi Tang教授,Masao Ohashi 研究员以及HKIChristian Hertweck教授为该文的通讯作者 


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