ChemCatChem:从吲哚合成靛蓝类染料的P450BM3过加氧酶的实验室进化

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中国科学院青岛生物能源与过程研究所丛志奇研究员课题组与山东大学李盛英教授课题组合作通过蛋白质工程对双功能小分子促进的P450过加氧酶进行实验室改造,开发出从吲哚及其衍生物出发催化靛蓝类染料合成的新型工程化P450酶,催化效率优于已报道的最佳氧化酶,为靛蓝类燃料的生物合成提供了新的策略和思路。



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图1 (A)氧化酶催化吲哚羟化合成靛蓝的主要途径。(B) 双功能小分子协同P450BM3过加氧酶体系的催化循环(左),双功能小分子的一般结构(DFSM,右上),N-(ω-咪唑基)-己酰基-L-苯丙氨酸的分子结构(Im-C6-Phe,右下)。

靛蓝作为重要的天然着色剂,是我们日常生活中牛仔衣裤的染色原料,并且广泛用于印染、食品、医药和电子材料行业。传统的植物提取工艺繁琐,产量低;化学合成方法有毒副产物、危害健康,所以开发环保高效的生物合成方法显得尤为重要。近年来微生物合成方法被广泛报道,但是酶合成方法因具有反应周期短、产物易分离等优点成为更合适的生物催化策略。细胞色素P450单加氧酶是公认的多功能生物氧化催化剂,已报道的工程P450酶生物合成靛蓝的产量较低不能满足工业应用的需求。另外,绝大多数P450单加氧酶催化功能的实现高度依赖提供还原力的辅酶NAD(P)H和负责电子传递的还原伴侣蛋白,这在一定程度上限制了其体外催化应用。针对以上问题,丛志奇研究员前期开发了“双功能小分子协同P450过加氧酶”策略,成功将单加氧酶P450BM3改造为以过氧化氢作为末端氧化剂的P450过加氧酶,为P450催化的非天然底物氧化转化提供了新的策略。

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最近,研究人员通过连续的实验室进化策略(理性设计、定向进化、半理性设计),获得双功能小分子促进的P450过加氧酶优势突变酶,能够高选择性催化吲哚合成靛蓝,是目前报道酶催化合成靛蓝中的最佳氧化酶。另外,以12种不同取代吲哚衍生物为原料制备了不同产率(31.3%-79.5%)的靛蓝类染料,证明该体系具有广泛的底物普适性,6,6’-二氟靛蓝的产率达到79.5%,优于目前报道最好的氧化酶PTDH-mFMO。其中优势突变酶对典型吲哚衍生物的催化效率(kcat/Km)为182-2849 mM-1·min-1,优于目前报道的所有P450酶。该研究显示蛋白质工程与双功能小分子协同P450过加氧酶策略的有机结合实现了靛蓝类衍生物的高效生物合成,为生物合成靛蓝类染料提供了新的酶催化途径,为生物工业化合成靛蓝类染料提供了新的思路。

文信息

Evolving a P450BM3 Peroxygenase for the Production of Indigoid Dyes from Indoles

Fanhui Kong, Jie Chen, Xiangquan Qin, Chuanfei Liu, Yiping Jiang, Li Ma, Prof.  Huifang Xu, Prof. Shengying Li, Prof. Zhiqi Cong


ChemCatChem

DOI: 10.1002/cctc.202201151




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