分享一篇发表在JACS上的文章：After 75 Years, an Alternative to Edman Degradation: A Mechanistic and Efficiency Study of a Base-Induced Method for N‑Terminal Peptide Sequencing，通讯作者是来自德克萨斯大学奥斯汀分校的Eric V. Anslyn教授和Edward M. Marcotte教授。Anslyn教授课题组主要研究方向是物理有机化学、超分子化学和材料化学，并设计一些传感系统；Marcotte教授课题组的研究兴趣包括蛋白质组中蛋白功能、表达和定位，以及单分子蛋白测序技术。

Edman降解法是一种经典的多肽测序技术，通过重复使用苯异硫氰酸酯（PITC）处理肽的 N端氨基，然后用三氟乙酸处理来获取肽链的氨基酸序列信息，在生物化学和分子生物学等领域发挥了重要作用。然而，随着蛋白质组学的发展，对蛋白质测序技术的要求不断提高，传统的Edman降解法在某些情况下受限，例如不适用于处理酸敏感的肽段或含有酸敏感功能团的蛋白质。因此，开发一种新的非酸性N端肽测序方法具有重要的科学意义和应用价值。

本文作者的主要目标是开发一种碱诱导的降解方法。根据文献报导，在非酶催化中，碱可以辅助酰胺键水解，其机理涉及氢氧根对羰基碳的亲核进攻，形成四面体中间体。降解的第二步是肽的环化和氨基离去。作者研究了各种肽裂解的环化作用，例如，在高温（130 °C）和中性pH值条件下，N端氨基酸与相邻酰胺之间的分子内环化作用会形成二酮哌嗪，并释放出截短肽。受文献启发，作者通过改变离去基团和亲核物种迭代改进降解试剂（DRs）的性能，其中有两个关键组成部分：一个是用于选择性N端衍生化的离去基团，另一个是用于促进环化的良好亲核试剂。作者选择以N-羟基琥珀酰亚胺作为离去基团、肼甲酰胺作为超亲核试剂合成了多种N 端衍生化试剂，经过多轮迭代设计和实验筛选，发现化合物DR3在肽衍生化步骤中产率最高，且仅在1%的氢氧化物盐中就能最有效地消除N端氨基酸。

随后，作者将肽与DR3在特定条件下进行反应，使N端氨基酸与DR3发生衍生化。然后加入碱，促使N端氨基酸的消除。通过LC-MS/MS等技术对反应产物进行分析，确定衍生化和消除反应的效率，并考察该方法对不同氨基酸的适用性。作者利用该方法成功地从N端移除了所有20种氨基酸，并且与Edman降解相比，对于某些特定氨基酸（如半胱氨酸和蛋氨酸），表现出更高的测序效率和准确性，这可能是因为在碱性条件下，这些氨基酸的反应活性更高或更稳定。

总而言之，本文作者开发了一种新的碱诱导N端降解方法，为蛋白质测序提供了一种有价值的替代方案，特别是在处理酸敏感样品和需要同时分析蛋白质与核酸的情况下具有独特的优势。

本文作者：MB

责任编辑：LZ

DOI：10.1021/jacs.5c03385

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c03385