分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“Assembling Ternary Dead-End Complex for Covalent Trapping of Protein Lysine Methyltransferases”，通讯作者是来自Weill Cornell Medical College的Minkui Luo教授，其研究方向是：提供化学遗传工具，以定义、扰动和控制蛋白质甲基转移酶的关键功能。

蛋白质赖氨酸甲基化是一种关键的表观遗传修饰，通过最小程度地改变赖氨酸侧链的电荷和大小，在细胞命运决定中发挥重要作用。人类基因组编码超过60种蛋白质赖氨酸甲基转移酶（PKMTs），它们以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为辅因子，对组蛋白和非组蛋白上的数千个赖氨酸残基进行高度调控的甲基化。然而，目前大部分研究集中在对PKMT的底物谱进行大规模鉴定，例如通过SAM的炔基衍生类似物，鉴定蛋白质组中的甲基化位点。本文旨在从另一个角度研究甲基化，即鉴定特定位点的蛋白质赖氨酸甲基转移酶。

本文开发了一项名为“共价捕获蛋白质赖氨酸甲基转移酶”的新技术，其核心思路是通过组装“三元死端复合物”，利用底物-辅因子替代物直接捕获与特定甲基化位点相关的PKMTs。探针包含三个关键部分：a) 中央的Nle替代底物赖氨酸；b) 邻近Nle的光交联氨基酸，用于共价结合PKMTs；c) C端的生物素锚点，便于靶标富集。

本文首先在纯蛋白上优化了Lys替代物以及SAM替代物部分，通过筛选多种底物（Nle、Met、Phe）和辅因子（SAM、SAH、SNF）组合，发现Nle-SAM对捕获效率最高。然后作者先在组蛋白上进行了验证：对经典组蛋白位点（H3K4/9/27/36和H4K20）设计CTPM探针，然后通过WB以及质谱实验证明了探针能特异性富集已知甲基转移酶，例如对于H3K9，他们富集出了5个已知的PKMT中的4个，对于H4K20富集出了3个已知的PKMT中的1个。作者在这部分强调了光交联分析时，关注相对强度而非绝对强度的重要性，例如对于H3K9和H3K9Nle，PRDM9的绝对强度都很高，但是没有特异性，后续他们验证了其结合位点并非位于PKMT的催化位点。

最后作者将CTPM应用于非组蛋白的转录因子FOXO1的K273位点，在HEK293T细胞核中揭示了SUV39H1、EZH2和GLP作为新型PKMTs，通过体外放射性测定和质谱分析，进一步验证了EZH2介导的FOXO1 K273单甲基化。

总的来说，本文通过Nle-SAM配对模拟PKMT催化过渡态，进一步引入光交联基团和富集基团，开发了CTPM技术，可以揭示某一位点的PKMT谱。

本文作者：YDP

责任编辑：WYJ

DOI：10.1021/jacs.5c14571

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c14571