on style="max-width: 100%; box-sizing: border-box; color: rgb(62, 62, 62); white-space: normal; background-color: rgb(255, 255, 255); overflow-wrap: break-word !important;">“ 本文为美国德州农工大学（Texas A & M University） 化学系刘文设（Wenshe R. Liu）教授课题组最新发表的研究性论文，主要介绍了一种利用小分子硝基供体活化蛋白质中的半胱氨酸进而实现无内含肽介导的蛋白质连接技术。本文成功将一系列L/D-氨基酸以及肼连接至蛋白质内重组的半胱氨酸位点并进行了质谱表征，同时也展示了此方法在合成基于酶活性的蛋白探针和荧光探针、引入非天然氨基酸、自然化学连接技术、多肽药物合成等方面的应用。”
半胱氨酸作为唯一一个侧链含有游离态巯基的天然氨基酸，具有自然丰度低、侧链亲核能力强的特点。在自然界中，半胱氨酸在体内存在着一系列对细胞结构和功能具有重要作用的转录后修饰，这进一步佐证了其成为了一个理想的化学修饰位点的潜在应用能力。自1994年以来，随着现代化学生物学的高速发展，科学家们提出了并逐渐完善了自然化学连接技术（native chemical ligation）、表达蛋白连接技术（expressed protein ligation）、酰肼连接技术（hydrazide ligation）等一系列基于半胱氨酸的蛋白质连接技术，这些技术的出现很大程度上为人工合成天然蛋白质创造了可行的条件。但是，这些现存的技术或多或少都存在一些缺陷，例如利用内含肽介导的方法无法保证合成出大量的蛋白质硫酯，作为重要的反应中间体的硫酯也具有不稳定、易水解的特点。因此，科学家们急需一种更简单高效、不需要酶作为中间介质且可以应用于不同蛋白或多肽的蛋白质碳端功能化方法，以达到合成所需蛋白质以用于医疗及科研当中。
最近，美国德州农工大学（Texas A&M University）化学学院的刘文设（Wenshe R。 Liu）教授课题组提出了一种在水溶液中可以进行且不需要内含肽作为介导的表达蛋白连接技术。这种技术基于使用一种水溶性较好的氰基供体化合物2-硝基-5-硫氰基苯甲酸（2-nitro-5-thiocyanatobenzoicacid）活化半胱氨酸侧链并生成1-酰基-2-亚氨基并噻唑烷中间体以降低半胱氨酸氮端羰基的电子云密度从而使其更容易被亲核试剂进攻。通过向反应体系中提供不同的具有亲核能力的含氨基小分子化合物，并改变R基团的组成，此技术理论上可以将任何官能团引入目标蛋白质中半胱氨酸-1位的氨基酸的碳端，以达到蛋白质碳酸功能化的目的。
图1.基于活化半胱氨酸侧链的蛋白质连接技术的反应及其机理
该论文首先利用有机合成获得的含半胱氨酸的二肽进行了成功的测试反应，进而将其应用扩展至蛋白层面，利用泛素蛋白（Ub）为模型，尝试并成功将9种不同的D/L-氨基酸和3种不同的含有官能团取代的小分子氨基化合物连接至泛素的G76C（甘氨酸变异成为半胱氨酸）变异体上。与此同时，为了证明半胱氨酸-1位蛋白质对反应的影响，G75位的不同氨基酸变异的泛素和77位半胱氨酸异变体也成功被证明可以很好地进行这种蛋白链接反应。另外，成功地将肼与Ub-K48C和Ub-K63C的蛋白异变体进行反应进一步证实了泛素蛋白游离的碳端不是促使反应发生的必要因素，为此技术的广泛应用性提供了坚实的实验基础。
图2. 利用泛素进行的基于活化半胱氨酸侧链的蛋白质连接技术的测试
该论文接着介绍了利用基于活化半胱氨酸侧链的蛋白质连接技术制备的基于酶活性的类泛素蛋白探针（activity-based probe）和荧光蛋白探针并将其结合Western印迹技术对蛋白质的功能进行分析。同时，此方法还可以用于引入通过正常非天然氨基酸引入技术难以企及的碳端修饰氨基酸例如组蛋白H2AK129酰基化，以及结合酰肼连接法进行RNA水解酶的蛋白质连接合成。另外，此方法还可以用于大量快速合成含有碳端修饰的药用多肽，用以提高其产量与成本。
图3. (A) 利用基于活化半胱氨酸侧链的蛋白质连接技术制备的基于酶活性的类泛素蛋白探针与其对应的解离酶之间的反应；(B) 利用基于活化半胱氨酸侧链的蛋白质连接技术制备的荧光蛋白探针的解离酶活性的荧光测试；(C) 利用基于活化半胱氨酸侧链的蛋白质连接技术制备的组蛋白H2A碳端酰基化修饰引入； (D) 利用基于活化半胱氨酸侧链的蛋白质连接技术结合酰肼连接法合成RNA水解酶RNH。
综上所述，基于活化半胱氨酸侧链的蛋白质连接技术可以被广泛应用于在蛋白质碳端进行多种不同的修饰。其反应条件简单、可控、温和的特点有利于在最简单的化学生物学课题组进行，对实验条件没有过分苛刻的要求。利用此技术进行蛋白质碳端的修饰，可以大大简化蛋白质的合成步骤并扩展其应用至工业合成领域，也可以用更方便快捷的办法帮助科研工作者得到实验中所需要的蛋白质探针等重要研究材料。
相关工作发表在J. Am. Chem. Soc. (DOI: 10.1021/jacs.0c00252)，原文PDF版链接如下,或直接点击最下方阅读原文：https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.0c00252
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