on style="white-space: normal;">中国科学院上海{attr}3220{/attr}化学研究所刘文课题组一直致力于2,2’-联吡啶类抗生素Caerulomycin (CAE)和Collismycin (COL)的生物合成研究，他们通过基因挖掘技术克隆了这两种天然产物的生物合成基因簇，发现这两种天然产物的联吡啶骨架由极为相似的聚酮-非核糖体聚肽杂合酶 （polyketide synthase-nonribosomal peptide synthetase hybrid, PKS-NRPS)合成，确定了两种化合物的生物合成前体（J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 9038–9041）并解析了两种天然产物重要的骨架后修饰生物合成反应（Org. Biomol. Chem.2017, 15, 5472–5475; Synth. Syst. Biotechnol. 2017, 2, 137–146.)。近期，该团队通过详尽的体内和体外研究，解析了PKS-NRPS装配线合成2,2’-联吡啶核心结构的生物合成机制：该联吡啶核心环的形成需要新颖的黄素蛋白和装配线上特殊的缩合功能域C（缩合功能域）、Cy（缩合环化功能域）和Ct（末端缩合功能域）共同参与，完成C-N键、C-C键的形成以及选择性的C-S键断裂获得脱硫（CAE）或者不脱硫（COL）的2,2’-联吡啶核心结构（Nat. Commun. 2021, 12, 3124)。聚酮合酶 (polyketide synthase, PKS) 和非核糖体聚肽合成酶 (nonribosomal peptide synthetase, NRPS)合成了为数众多的聚酮，聚肽，和聚酮-聚肽杂合的天然产物，其中大量化合物已作为临床药物使用，例如抗感染的红霉素，治疗癌症的博来霉素，对抗器官移植后免疫排异反应的雷帕霉素和他克莫司等。在生物合成上，这两类酶一般使用多模块的线性流水线的方式合成化合物骨架：各模块由基本的底物上载功能域，底物挂载功能域和缩合功能域组成，底物中间体以共价键形式与底物挂载功能域相连并逐步经各模块延伸得到长链，最终由链解离功能域作用成环或成为自由长链。除基本的底物上载和链延伸的反应外，中间体还可能发生多样的修饰反应并反映在最终的结构多样性中。由于这种模块化的线性生物合成，PKS和NRPS被视为具有极大的工程化改造潜力，以合成天然产物类似物和从头设计的化合物。除常见的氧化还原，脱水，甲基转移等反应外，PKS和NRPS上还存在较为复杂并多样化的修饰反应，由于体系的复杂性及技术难度，还没有得到充分表征。这些修饰反应常合成独特的有应用价值的化学结构，对其生物合成机制的解析将拓宽PKS和NRPS的合成生物学的应用。因此，本研究不仅解释了CAE和COL这两种具有药用价值天然产物的生物合成途径，而且解析了的PKS-NRPS经复杂的装配线上修饰反应合成2,2’-联吡啶这一应用广泛的结构单元的机理，为相关的合成生物学应用奠定了基础。
在本工作中，基于前期研究，该团队推测CAE核心联二吡啶结构由CaeA1、CaeA2和CaeA3蛋白构成的PKS-NRPS途径合成，但是在体外重构时，发现单纯加入上述的装配线蛋白和必需的底物分子吡啶甲酸、丙二酰CoA、半胱氨酸和异亮氨酸并不能重构核心联吡啶中间体（1）,只有额外加入黄素蛋白CaeB1时才能成功重构。由此，确定黄素蛋白CaeB1参与了核心吡啶环的形成。然后，根据对PKS-NRPS蛋白识别的底物分析，该团队推测该黄素蛋白参与了联吡啶在PKS-NRPS杂合蛋白CaeA2上的形成。然而，正如前所述，PKS和NRPS中的所有反应中间体均共价连接于巨大的多功能域蛋白的载体蛋白功能域 （CP）上，因此一般的生物合成研究方法如游离中间体表征和活性测试等技术均不适用于该类反应机制的研究。为捕捉相关反应中间体，刘文团队发展了一种基于蛋白质组学的方法来检测PKS和NRPS装配线蛋白上中间体检测的方法：经以提高相关中间体检测灵敏度为目的工程化改造的CaeA2蛋白经胰酶-糜酶酶解和质谱分析后，结合多种蛋白质组学软件对数据进行处理最终获得所有的载体蛋白功能域上的中间体信息。通过这套检测方法，该团队发现黄素蛋白CaeB1作用的底物是CaeA2-的肽载体蛋白功能域（PCP）上挂载的半胱氨酸，并且CaeB1要发挥功能需要通过CaeA2末端的Ct功能域进行招募。Ct通过蛋白质相互作用将CaeB1招募到装配线上，CaeB1再催化PCP上的半胱氨酸氧化脱氢，获得PCP连接的脱氢半胱氨酸。进一步，Cy功能域催化脱氢半胱氨酸与上游NRPSCaeA1-PKS CaeA2缩合获得的酰基底物进行C-C键连接，获得线性中间体（12），再脱硫、环化或者直接环化形成C-N键获得CaeA2蛋白上挂载的联吡啶中间体。该中间体进一步能被CaeA3或者ColA3蛋白识别和亮氨酸缩合形成CAE或者COL生物合成途径的中间体（1）和（15），其中A3蛋白的C功能域起到门控的作用，特异性地识别脱硫（CaeA3）或者不脱硫（ColA3）的联吡啶中间体进行后续延伸,修饰获得CAEs或者COLs。
在上述的研究中，作者发现了NRPS装配线上缩合功能域的3个新功能：首次报道了Ct功能域具有招募黄素蛋白的招募功能，这是继糖肽类抗生素中X功能域招募P450外的第二例装配线上招募蛋白的报道。此外，验证了Cy功能域除了催化常规C-N键的功能外，还能催化C-C键的形成；以及通过A3蛋白C功能域的门控功能，决定了联吡啶或者巯基联吡啶在后续转化中的命运。该工作加深了对装配线上修饰化学的理解，增加了催化功能域的功能多样性，为进一步拓宽PKS和NRPS的合成生物学应用提供了理论基础。
刘文课题组庞博博士（现为加州大学伯克利分校助理科学家），上海精准医学研究院廖日晶博士和刘文课题组汤志军博士为本文的共同第一作者。该工作得到了国家自然科学基金委、中国科学院、上海有机所的大力资助。
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