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泛素化是真核生物所特有的一种蛋白翻译后修饰，其参与了真核生物众多信号通路的调节。泛素（UB）在泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的依次催化下，可以形成七种酰胺键连接的泛素链。不同连接形式的泛素链携带不同的信息，能够被具有UB结合域（UBD）的蛋白和E1，E2，E3或去泛素化酶（DUB）特异性的识别。目前，通过合成特异连接的diUB探针来破译由蛋白质泛素化介导的细胞信号传导已成为该领域的研究热点。然而合成具有特异连接的泛素链一直是一项挑战。
为了解决这一问题，佐治亚州立大学尹骏教授课题组发展了一种简单高效的特异连接diUB探针的合成方法。利用遗传密码子扩展技术，将化学合成的非天然氨基酸（UAA）Nε-L-thiaprolyl-L-Lys (L-ThzK)引入泛素分子的特异位点，再通过蛋白质连接来实现特异连接的双泛素分子探针的合成。
图1. 特异连接双泛素分子探针的合成，以及与E2，E3，DUB的反应 作者首先通过UAA嵌合技术，将非天然氨基酸ThzK引入到泛素分子的特定位点（K11, K48 或K63）。之后通过甲基羟胺实现了从ThzK到半胱氨酸共轭赖氨酸（CysK）的转化，从而完成了受体UB的制备工作。对于供体UB的制备，作者通过几丁质（chitin）亲和层析纯化UB(1-75)和内含肽（intein）的融合蛋白，再用2-巯基乙磺酸钠（MESNa）对内含肽融合蛋白进行柱上裂解，从而释放出供体UB。之后通过化学接合法（chemical ligation）在供体UB和受体UB之间形成具有特异异肽键的diUB分子。 接下来作者验证了特异连接的diUB探针的反应活性。作者一方面以DiUB连接处的半胱氨酸残基作为反应手柄，与有着特异连接选择性催化活性的E2和E3之间形成二硫键，实现了diUB与E2、E3缀合物的合成。文章中成功展示了Ube2S (C118A)的催化结构域和K11-diUB，Huwe1 HECT结构域的单半胱氨酸突变体和K48-diUB，以及Nedd4 HECT结构域的单半胱氨酸突变体和K63-diUB之间的共价连接，形成了包括受体UB，供体UB和催化特异连接的E2或E3的三元缀合物。 另一方面，合成的diUB可以通过脱硫反应得到脱氢丙氨酸（Dha），并以新形成的Michael加成受体作为另一个反应手柄，来捕获具有亲核半胱氨酸残基的DUB。文章中作者成功测试了Dha功能化K48-diUB探针与可以识别K48泛素链的DUB OTUB1, OTUB2和USP2 的反应性。 该工作中作者成功通过UAA嵌合技术实现了特异连接的diUB分子探针的合成，并展示了该技术在UB缀合物合成中的巨大潜力，从而为探索泛素转移的生化机制以及破译细胞中蛋白质泛素化携带的生物信号提供了强大工具。 论文信息 Linkage-Specific Synthesis of Di-ubiquitin Probes Enabled by the Incorporation of Unnatural Amino Acid ThzK Dr. Han Zhou, Tomaya Carpenter, Xuan Fu, Bo Jin, Britton Ody, Mohammad Sazid Hassan, Savannah E. Jacobs, Jenny Cheung, Eve M. Nicholson, Prof. Dr. Mark Turlington, Prof. Dr. Bo Zhao, Dr. Sonja Lorenz, Prof. Dr. T. Ashton Cropp, Prof. Dr. Jun Yin ChemBioChem
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