发表在J. Am. Chem. Soc.上的“Poly(dehydroalanine): synthesis, properties, and functional diversification of a fluorescent polypeptide”。本文通讯作者是来自UCLA的Timothy J Deming教授。

    脱氢丙氨酸(Dehydroalanine, Dha)属于α, β-不饱和氨基酸，它是蛋白质中的丝氨酸或半胱氨酸经过酶催化消除反应得到的。由于独特的平面结构，Dha残基导致蛋白质中出现反向γ-转角，连续的3-6个Dha残基将导致蛋白质采取伸展2₅螺旋构象。此外，它还能作为亲电位点，与氨基、巯基等亲核基团反应，构建环状蛋白。合成高聚合度的聚(脱氢丙氨酸)(poly(dehydroalanine), A^DH)有利于研究Dha的反应性以及其对蛋白质构象的影响。目前，研究者们已经尝试采用逐步合成以及N-羧基内酸酐(N-carboxyanhydride, NCA)的开环聚合等方法制备A^DH。然而，现有方法存在产率低、合成步骤复杂、产物纯度低等问题。如图1所示，Dha NCA的开环聚合存在自由基加成聚合等多种副反应。

图1. Dha NCA的开环聚合以及副反应

    为了解决A^DH制备存在的问题，作者采取聚合后修饰方法替代Dha NCA直接开环聚合方法。如图2所示，研究者们已经开发出多种后修饰方法向蛋白质中引入Dha残基，前体通常是丝氨酸或者半胱氨酸残基。但是，聚(丝氨酸)、聚(半胱氨酸)及它们的衍生物大都采取β-折叠构象，在常见溶剂中的溶解度均很低，显著降低后修饰效率。因此，作者向侧链引入大位阻的叔丁基，制备得到聚((S-叔丁氧基羰基甲基)-_L-半胱氨酸))(poly(S-(tert-butoxycarbo- nylmethyl)-_L-cysteine), C^BCM)，有效防止了β-折叠的形成，聚合过程中体系始终保持澄清(如图3所示)。如图3所示，(S-叔丁氧基羰基甲基)-_L-半胱氨酸NCA((S-(tert-butoxycarbo- nylmethyl)-_L-cysteine NCA, tBuCM-Cys NCA)在THF中显示出活性聚合特征，FT-IR和CD表征表明得到的聚合物C^BCM呈现伸展的螺旋构象。

图2. 多肽或者蛋白质中Dha残基的合成方法

图3. C^BCM的制备方法

    C^BCM能通过氧化消除或者烷基化消除得到A^DH，但是产率很低。经尝试，作者将叔丁基保护基脱除，得到水溶性C^CM(如图4所示)，使得消除反应能在弱碱性水溶液中进行。37 ^oC、pH 8条件下，C^CM氧化消除反应产率约8%，但甲基化消除反应产率较高。反应体系中加入少量丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene, BHT)能避免Dha参与的自由基类副反应。如图5(B)、(C)所示，产物的核磁谱图显示出清晰的双键吸收峰，表明Dha的生成。结合计算，作者认为A^DH将采取介于2₅螺旋和3₁₀螺旋的构象。聚合度低时，它更倾向形成2₅螺旋；聚合度高时，它更倾向形成3₁₀螺旋。

图4. 由C^BCM制备A^DH的方法

图5. A^DH的相关表征。(A) HFIP相GPC；(B) A^DH₅₀的¹H NMR；(C) A^DH₉₀的固相CP-MAS ¹³C NMR；(D)  A^DH₆₈的固相FT-IR谱图

    作者对A^DH的光学性质进行探究。由于结构相近，作者将聚丙氨酸(A₅₃)作为对照组，对A₅₃和A^DH₆₈进行了紫外-可见吸收/发射光谱的测定。如图6所示，A^DH₆₈具有更大的共轭体系，导致其最大紫外吸收波长红移(220 nm，A₅₃的紫外吸收约为200 nm)。同时，A^DH₆₈还表现出很强的蓝色荧光，发射波长为440 nm。通过动态光散射，作者发现A^DH₆₈在以上实验所用溶剂(HFIP)中聚集，推测它可能具有类似聚集诱导发光(aggregation-induced emission, AIE)。另外，作者利用A^DH中的α, β-不饱和双键，与含巯基等亲核基团的小分子反应，制备了多种内消旋聚氨基酸。随着修饰率的上升，反应体系的荧光发射强度下降。

图6. A₅₃和A^DH₆₈在HFIP中的光学性质(浓度均为0.1 mg/mL)

    综上所述，本文作者设计一种新的可溶性聚(半胱氨酸衍生物)作为前提，通过聚合后修饰策略成功制备了高聚合度的聚(脱氢丙氨酸)。该材料具有特殊的螺旋结构和特征的荧光发射。它还能被具有巯基、氨基等亲核基团的小分子修饰，制备多种功能化内消旋聚氨基酸。

作者：LXY    审校：WS

DOI: 10.1021/jacs.2c00383

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c00383