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发表在J. Am. Chem. Soc.上的“Poly(dehydroalanine): synthesis, properties, and functional diversification of a fluorescent polypeptide”。本文通讯作者是来自UCLA的Timothy J Deming教授。
脱氢丙氨酸(Dehydroalanine, Dha)属于α, β-不饱和氨基酸,它是蛋白质中的丝氨酸或半胱氨酸经过酶催化消除反应得到的。由于独特的平面结构,Dha残基导致蛋白质中出现反向γ-转角,连续的3-6个Dha残基将导致蛋白质采取伸展25螺旋构象。此外,它还能作为亲电位点,与氨基、巯基等亲核基团反应,构建环状蛋白。合成高聚合度的聚(脱氢丙氨酸)(poly(dehydroalanine), ADH)有利于研究Dha的反应性以及其对蛋白质构象的影响。目前,研究者们已经尝试采用逐步合成以及N-羧基内酸酐(N-carboxyanhydride, NCA)的开环聚合等方法制备ADH。然而,现有方法存在产率低、合成步骤复杂、产物纯度低等问题。如图1所示,Dha NCA的开环聚合存在自由基加成聚合等多种副反应。
图1. Dha NCA的开环聚合以及副反应
为了解决ADH制备存在的问题,作者采取聚合后修饰方法替代Dha NCA直接开环聚合方法。如图2所示,研究者们已经开发出多种后修饰方法向蛋白质中引入Dha残基,前体通常是丝氨酸或者半胱氨酸残基。但是,聚(丝氨酸)、聚(半胱氨酸)及它们的衍生物大都采取β-折叠构象,在常见溶剂中的溶解度均很低,显著降低后修饰效率。因此,作者向侧链引入大位阻的叔丁基,制备得到聚((S-叔丁氧基羰基甲基)-L-半胱氨酸))(poly(S-(tert-butoxycarbo- nylmethyl)-L-cysteine), CBCM),有效防止了β-折叠的形成,聚合过程中体系始终保持澄清(如图3所示)。如图3所示,(S-叔丁氧基羰基甲基)-L-半胱氨酸NCA((S-(tert-butoxycarbo- nylmethyl)-L-cysteine NCA, tBuCM-Cys NCA)在THF中显示出活性聚合特征,FT-IR和CD表征表明得到的聚合物CBCM呈现伸展的螺旋构象。
图2. 多肽或者蛋白质中Dha残基的合成方法
图3. CBCM的制备方法
CBCM能通过氧化消除或者烷基化消除得到ADH,但是产率很低。经尝试,作者将叔丁基保护基脱除,得到水溶性CCM(如图4所示),使得消除反应能在弱碱性水溶液中进行。37 oC、pH 8条件下,CCM氧化消除反应产率约8%,但甲基化消除反应产率较高。反应体系中加入少量丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene, BHT)能避免Dha参与的自由基类副反应。如图5(B)、(C)所示,产物的核磁谱图显示出清晰的双键吸收峰,表明Dha的生成。结合计算,作者认为ADH将采取介于25螺旋和310螺旋的构象。聚合度低时,它更倾向形成25螺旋;聚合度高时,它更倾向形成310螺旋。
图4. 由CBCM制备ADH的方法
图5. ADH的相关表征。(A) HFIP相GPC;(B) ADH50的1H NMR;(C) ADH90的固相CP-MAS 13C NMR;(D) ADH68的固相FT-IR谱图
作者对ADH的光学性质进行探究。由于结构相近,作者将聚丙氨酸(A53)作为对照组,对A53和ADH68进行了紫外-可见吸收/发射光谱的测定。如图6所示,ADH68具有更大的共轭体系,导致其最大紫外吸收波长红移(220 nm,A53的紫外吸收约为200 nm)。同时,ADH68还表现出很强的蓝色荧光,发射波长为440 nm。通过动态光散射,作者发现ADH68在以上实验所用溶剂(HFIP)中聚集,推测它可能具有类似聚集诱导发光(aggregation-induced emission, AIE)。另外,作者利用ADH中的α, β-不饱和双键,与含巯基等亲核基团的小分子反应,制备了多种内消旋聚氨基酸。随着修饰率的上升,反应体系的荧光发射强度下降。
图6. A53和ADH68在HFIP中的光学性质(浓度均为0.1 mg/mL)
综上所述,本文作者设计一种新的可溶性聚(半胱氨酸衍生物)作为前提,通过聚合后修饰策略成功制备了高聚合度的聚(脱氢丙氨酸)。该材料具有特殊的螺旋结构和特征的荧光发射。它还能被具有巯基、氨基等亲核基团的小分子修饰,制备多种功能化内消旋聚氨基酸。
作者:LXY 审校:WS
DOI: 10.1021/jacs.2c00383
Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c00383
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