Sensors and Actuators B: Chemical┃NADH诱导的“启动”荧光探针验证氧化还原调节剂GSH的串扰

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分享一篇发表在Sensors and Actuators B: Chemical上的文章,题目是“NADH- induced “kick-on” fluorescent probe validates crosstalk with redox regulator GSH”,文章的通讯作者为JIS Institute of Advanced Studies and RsearchSankarprasad Bhuniya副教授。


氧化还原偶对1,4-二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD+)是真核细胞中普遍存在的电子转运体。NADH作为中心代谢过程的辅酶,通过三羧酸循环(TCA)、糖酵解和戊糖磷酸途径将碳源转化为各种分子前体。代谢通量严格控制NADH/NAD+的比例,以完成各种代谢和分解过程,将不同的大分子转化为能量。然而,NADH水平的升高会扰乱多种代谢过程,从而可能引发ROS的形成、DNA损伤和癌症转移此外,高糖酵解通量提高了NADH水平,维持了癌细胞增殖过程中对能量的高需求。因此,通过开发合适的激动剂或拮抗剂,操纵NADH水平可以成为停止各种代谢紊乱和癌症生长的独特解决方案。为此,需要一种有效的工具来评估单个细胞中NADH的表达,而不损害任何健康细胞;这将是化学选择性的,能够提供准确的信息,而不会受到活细胞中其他反应性时间物质的干扰。有几种方法,如电化学,酶测定等,用于跟踪活细胞中的NADH。除此之外,高灵敏度的荧光吸引策略材料,如小分子荧光探针、基因编码蛋白和纳米颗粒已被用于跟踪活细胞中的NADH。最近,基于“推池”机制的几种荧光探针被用于跟踪活细胞中的NADH。一项新的研究表明,氧化还原偶、GSH/GSSGNAD+/NADH的失衡改变了氧化还原稳态,加速了生理性ROS的形成;这会引起各种生理障碍,如中风、血脂异常、糖尿病、高血压等。因此,我们有兴趣研究氧化还原对、NAD+/NADHGSH/GSSG之间是否存在注释效应;这可能为开发针对ROS诱导的致病性疾病的合适拮抗剂打开了新的窗口。因此,需要一种新的荧光探针,它可以合成简单,并且可以在活细胞中快速精确检测NADH。本文主要讨论探针PNADH的合成路线、在NADH存在下其紫外可见光谱和荧光光谱的变化、荧光成像对活细胞中NADH的跟踪以及与氧化还原调节剂GSH的串扰。
为了证实我们的观点,我们合成了一种新的开启探针PNADH(方案1)来验证活细胞中NADH的表达水平。


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方案1. 荧光探针PNADH的合成及其在NADH存在下的分解。


在该策略中,NADH还原了PNADH中喹啉C4上的芳π键,促进了不稳定碳酸盐键的自烧裂解,释放荧光团(FL)(方案1)。首先,我们评估了用不同浓度的NADH (0 ~ 400 μM)滴定探针PNADH检测NADH的效价。探针PNADH在以552 nm为中心的荧光强度随NADH的剂量线性增加,且呈良好的线性关系,系数(R)0.987(1a)。此外,在时间依赖性荧光研究中(1b);我们注意到~ 40分钟后在400 μM NADH存在下,PNADH完全转化为FLNADH催化PNADH生成FL的时间依赖性也与时间保持良好的线性关系(R = 0.997)。由回归方程得到的NADH计算值表明,探针PNADH可以检测到最小1.25 μMNADH


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1. a) pH 7.4时,PBS缓冲液(0.5% DMSO)中,用NADH (0 ~ 400 μM)滴定PNADH (5 μM)的发射光谱。b) PBS缓冲液(pH = 7.4)不同时间尺度(0 ~ 60 min)PNADH (5 μM)NADH 400 μM的荧光强度变化。


此外,我们使用Michaelis-mentenLineweaverBurk方程,通过确定动力学参数,如Michaelis常数(KM)、催化效率常数(kcat/KM)和周转数(kcat),估计了PNADHNADH之间的催化反应效率。KMkcatkcat/KM的取值分别为37.72 μM0.31 s−18.218 × 103 M−1 s−1(2)。较高的kcat/KM值表明PNADH是检测NADH的良好候选。


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2. a)不同PNADH浓度(0 ~ 20 μM)100 μM NADH552nm处随时间变化的发射强度增量。b) Michaelis-Menten阴谋。c) NADHPNADH还原的Lineweaver - Burke图。d)PBS缓冲溶液(0.5% DMSO)中,pH7.4,100 μMNADH37°C下孵育60 min后,荧光强度与不同浓度的PNADH (0-20 μM)的关系。


为了验证探针PNADH在活细胞中跟踪NADH表达的能力,我们在时间依赖性研究中(3),观察到PNADH能够在15分钟内提供HeLaMDA-MB 231WI-38细胞的绿色通道图像。之前Tang等人报道探针仅在10分钟内提供图像。这一发现表明该探针具有高度的细胞膜渗透性,并且对NADH具有反应性,可以避免活细胞中其他类似反应物质的干扰。此外,在剂量依赖性研究中,我们观察到细胞标记程度随着PNADH剂量(0-20 μM)的增加而增加(4);这显然是因为PNADH与细胞NADH之间的反应程度更大。


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3. PNADH孵育不同时间间隔(0-60 min)HeLaMDA MB-231WI-38细胞中NADH的时间依赖性跟踪。在500 nm的激发和520-600 nm的发射处采集图像。标尺100 μm。插入相应的DIC图像。

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4. 以不同剂量(0 ~ 20 μM)PNADHHeLaMDAMB -231WI-38细胞NADH的剂量依赖性跟踪,在500 nm处激发获得图像,520 ~ 600 nm处收集发射图像。标尺100 μm。插入相应的DIC图像。


接下来,我们研究了糖酵解途径中NADH依赖底物特异性的程度,其中NADH在电子传递级联中起着重要作用。有趣的是,在HeLaMDA mb -231WI-38细胞中,PNADH的荧光强度随着葡萄糖剂量的增加(0-20 mM)而增加(5)。这显然是由于葡萄糖在糖酵解途径中通过电化学还原NAD+生成NADH而形成氧化代谢物丙酮酸。


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5. 葡萄糖依赖性NADHHeLaMDAMB231WI-38细胞中的表达验证。对照组:未经PNADH处理的细胞。其他情况下,细胞与PNADH孵育40分钟,用不同剂量的d -葡萄糖(0-20 mM)预处理30分钟。在500 nm处激发获得图像,在520-600 nm处收集发射图像。标尺100 μm。插入相应的DIC图像。


接下来,通过估计活细胞中的NADH水平来评估丙酮酸在糖酵解过程中的作用。通常在癌细胞中,丙酮酸通过乳酸脱氢酶(LDH)的作用转化为乳酸,从而由NADH产生NAD+的电化学逆反应。
6a的结果表明,PNADH的荧光强度随着丙酮酸剂量的增加而逐渐降低。丙酮酸(Py)浓度的增加会通过将NADH氧化为NAD+,促进丙酮酸到乳酸(LA)的转化,从而维持丙酮酸-乳酸的平衡。从荧光强度谱(6c)中,我们可以得出结论,PNADH的荧光强度在10 mM丙酮酸存在下降低了约1.5倍。然后,我们研究了丙酮酸转化为乳酸及其反过来转化是否与细胞间NADH/NAD+动态变化有关。在图6b中,我们观察到乳酸(LA)培养后的HeLa细胞显示出强烈的荧光信号;相比之下,乳酸和丙酮酸预处理的细胞显示弱荧光图像(6b)。此外,图6d的强度分布图表明,乳酸-丙酮酸平衡在细胞NADH水平的变化中起着重要作用。


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6. HeLa细胞的荧光显微图像。对照组:未经PNADH处理的细胞。此外,(a)在不同剂量的丙酮酸(0-10 mM)处理前,将细胞与PNADH (10 μM)孵育40分钟;(b) PNADH预处理后的细胞分别用丙酮酸(5 mM)处理,然后用乳酸(10 mM)处理,最后两者同时处理。(c)(d)分别为(a)(b)两种情况下的荧光强度变化。与单独探针相比,**P < 0.001 **P < 0.01,与LA相比,#P < 0.001。激发和发射波长设置在500 nm/ 520-600 nm。标尺100 μm。插入相应的DIC图像。


目前的研究结果表明,在GSH水平较低的情况下,活细胞能够产生NADH来修复DNA,从而克服ROS影响氧化应激造成的细胞损伤。因此,我们有兴趣研究氧化还原调节剂GSH对活细胞中NAD+/NADH动态的作用。如图7a所示,在HeLa细胞中,由于高剂量GSH的影响,PNADH的荧光强度程度降低。根据image J的计算,我们发现在10 mM GSH预处理的HeLa细胞中,荧光强度降低了约2(7c)。另一方面,当GSH的生物合成程度受到BSO(丁硫氨酸亚砜胺)(0-5 mM)的限制时,PNADH处理的HeLa细胞的荧光强度随着BSO剂量的增加而变得更强(7b)。此外,图7d中的强度曲线表明,5 mM BSO预处理的HeLa细胞的荧光强度增加了约1.8倍,这显然是由于细胞NADH水平较高。验证GSHNAD+/NADH之间的串扰有助于进一步研究克服氧化应激的细胞内部机制。


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7. HeLa细胞的荧光显微镜图像,(a)(b)分别验证活细胞中GSH (0-10 mM)BSO (0-5 mM)依赖的NADH表达。对照组:未经PNADH处理的细胞。***P < 0.001 **P < 0.01 *P < 0.05。在500 nm的激发和520-600 nm的发射处采集图像。标尺100 μm。插入相应的DIC图像。


总之,我们展示了一种自焚荧光探针PNADH的合成和应用,用于活细胞中NADH表达的细胞内评估。在400 μMNADH存在下,探针PNADH的发射强度增加了约10倍。探针PNADH对活细胞无损伤,其对NADH的检测能力不受活细胞中其他类似分析物的干扰。化学选择性荧光探针PNADH可以快速(15分钟)提供活细胞中NADH水平的准确信息,而不会受到任何虚假荧光信号的干扰。它提供了NAD+/NADH在活细胞糖酵解循环中依赖于底物如葡萄糖、丙酮酸和乳酸的动态变化的信息。最后可视化细胞环境中NADH水平随GSH波动的变化;这可能为寻找合适的拮抗剂来克服高血压、中风等氧化应激相关疾病铺平道路。




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