细胞色素P450酶是一类以血红素为辅基的单加氧酶。P450酶具有广泛的底物特异性，能够识别和作用于多种不同类型的底物，已被广泛应用于医药、环境保护和农业等领域。P450酶需要氧化还原伴侣进行电子转移，而氧化还原伴侣的电子传递效率是P450酶催化的关键限速步骤。

由于缺乏系统的氧化还原伴侣工程策略，包括快速筛选合适的氧化还原伴侣、对氧化还原伴侣进行理性设计改造、对电子传递体系的机制解析等，因此很难有效地快速提高氧化还原伴侣的电子传递效率，从而提高P450酶的催化性能。

近日，江南大学的赵鑫锐研究员和厦门大学的王斌举教授合作，以P450酶OleP为研究对象，通过设计一种系统的氧化还原伴侣工程策略，可以高效地催化石胆酸制备鼠脱氧胆酸，为生物酶法催化制备甾体药物提供了一种有效的途径。

使用文献调研、数据库挖掘和序列比对等手段，建立了一个包含12对氧化还原伴侣的三组分氧化还原伴侣库。通过使用Alphafold2 Multimer对接铁氧还蛋白和P450酶并分析电子传递距离，快速虚拟筛选出5对比较合适的氧化还原伴侣。通过使用sfGFP感应器和全细胞催化实验，验证了氧化还原伴侣PetH/PetF最适配P450酶OleP（转化率32.5%）。

同时建立了快速检测石胆酸和鼠脱氧胆酸的高通量方法。文献表明使用强酸或强碱处理某些天然产物可以发生不同的化学反应，从而具有不同的特征吸收峰。基于此原理，该工作设计了一种使用75%硫酸-乙醇的96微孔板检测方法，实现了对石胆酸和鼠脱氧胆酸的高通量检测。

为了进一步提高PetH/PetF的电子传递效率，对铁氧还蛋白PetF进行设计改造。以高通量检测方法为基础，通过分析铁氧还蛋白PetF的结构信息，设计了一个包含48个氨基酸位点的突变体文库。应用FoldX软件进行突变体的设计和评估、sfGFP感应器筛选和全细胞催化验证，最佳突变体PetF_F64D的转化率提升到80.9%。

接下来解析了P450酶OleP催化体系中的电子传递机制。通过蛋白-蛋白复合物的分子动力学模拟，表明与野生型OleP-PetF相比，突变体OleP-PetF_F64D新增了一个静电相互作用位点（R105-F64D），从而将血红素到铁硫簇的平均距离由15.9 Å缩短至15.2 Å。由于电子传递距离的缩短，理论预测突变体OleP-PetF_F64D的电子传递速率也提高了2.9倍，这一计算结果与提升的转化率吻合。此外，电子传递路径的预测也揭示了参与电子传递的关键氨基酸。

最终，该工作利用氧化还原伴侣工程建立了高效的P450酶OleP电子转移系统来改善鼠脱氧胆酸生物合成效率。本文提出的氧化还原伴侣工程策略和高通量筛选方法为构建其他P450酶的理想氧化还原伴侣提供了一种可行的方法。

Establishing an Efficient Electron Transfer System for P450 Enzyme OleP to Improve the Biosynthesis of Murideoxycholic Acid by Redox Partner Engineering

Chixiang Sun, Yongchao Wang, Baodong Hu, Jianan Wang, Jingwen Zhou, Jianghua Li Jian Chen, Guocheng Du, Binju Wang, Xinrui Zhao

Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202423209