分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，题目为：A Covalent Targeted Platform for Protein Dynamic Tracking。本文通讯作者是中国地质大学（武汉）的娄筱叮教授，课题组主要致力于面向疾病早期诊断，发展用于活细胞蛋白质动态分析及高灵敏度检测的荧光探针与新型生物传感器件。

蛋白质是生命活动的基本执行者，其动态变化与疾病发生密切相关。当前蛋白质检测方法如ELISA、Western blot、质谱等虽灵敏准确，但无法在活细胞中原位、实时、长时程追踪蛋白质动态。荧光成像虽有潜力，但传统探针存在细胞内滞留时间短、清除快等问题，难以满足长期追踪需求。

针对上述挑战，作者提出了一种共价靶向成像平台（CTI），其设计策略如下图所示。CTI探针由三个模块构成：马来酰亚胺基团作为共价反应单元，可与目标蛋白半胱氨酸残基形成稳定共价键；靶向肽（如AVPI序列）负责特异性识别目标蛋白；荧光转子（QB）作为信号输出单元，其自由旋转受限时荧光增强。三者协同实现活细胞内蛋白质的长时程、高特异性成像。

作者以XIAP（X连锁凋亡抑制蛋白）为模型靶点，合成探针MXQ，并验证其性能。分子对接显示MXQ与XIAP结合能为-5.6 kcal/mol，结合亲和力Kd为82.94 nM，显著优于非共价对照探针XQ（210 nM）。SDS-PAGE和质谱证实MXQ与XIAP形成共价加合物。光物理实验表明MXQ对XIAP具有高灵敏度（检测限39.28 nM）和高选择性，且在pH 2–9范围内稳定。

在细胞层面，MXQ成功区分不同XIAP表达水平的细胞系（MCF-7 > MDA-MB-231 > HFL-1），并与线粒体共定位良好（Pearson系数0.82）。通过转染eGFP-XIAP，进一步证实MXQ对XIAP的特异性识别。更重要的是，MXQ在细胞内的滞留时间显著长于非共价探针XQ，荧光信号可持续36小时以上，为长时程动态追踪奠定基础。

作者进一步验证MXQ对XIAP动态变化的响应能力。通过转染pcDNA-XIAP上调XIAP表达，荧光增强约54%；通过siRNA敲低或LCL-161抑制剂处理，荧光分别下降60%和28%。Western blot验证了上述调控效果，表明MXQ可灵敏监测活细胞内XIAP水平的动态变化。

在功能应用层面，作者利用MXQ评估细胞增殖过程中的XIAP变化。β-雌二醇促进MCF-7增殖，荧光增强；顺铂抑制增殖，荧光减弱，与克隆形成实验结果一致。在小鼠肿瘤模型中，MXQ同样实现XIAP的长时成像，信号维持时间优于XQ，且LCL-161预处理组荧光降低，验证了其体内成像能力。

综上所述，本研究构建了一种共价靶向成像平台CTI，首次实现活细胞内XIAP蛋白的长时程动态追踪。该平台模块化设计具备良好的普适性，可通过更换靶向肽适配不同含半胱氨酸蛋白，也可通过改变反应基团扩展至其他亲核氨基酸残基。CTI平台为蛋白质功能研究、药物评估及疾病诊断提供了有力工具。

本文作者：JR

责任编辑：TZS

DOI：10.1021/acs.analchem.6c00347

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6c00347