Biomac专栏 | 相分离参与的多酶催化生物合成过程

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on style="white-space: normal; text-indent: 2em;">今天给大家分享一篇近期发表在Biomacromolecules上的文章,题为:Phase-Separated Multienzyme Biosynthesis。这篇工作中,作者在相分离形成的蛋白质凝集体中通过自组装作用引入催化酶,在体外构建了多酶生物合成体系。并且,相分离带来的浓缩效应,促使级联酶促反应更高效的进行。文章的通讯作者是来自香港中文大学的夏江教授,他主要从事蛋白质化学及酶工程方面的研究。

-液相分离(LLPS)是细胞中非常普遍的一个过程,生物大分子间通过多价相互作用,在高于临界浓度时会自发形成凝集体。这些凝集体被称为“无膜区室”,它们具有流动性与动态性,并且能够选择性地富集特定分子,从而提高级联催化过程的效率。这是因为当酶和底物聚集在凝集体中,可与其他代谢途径隔离,并且底物通道效应(级联反应过程中反应中间物在两个酶之间的直接传递)也使得酶促反应的速率大大提高。先前已有将相分离过程应用于多酶复合物的策略,例如通过将相形成过程中的骨架蛋白与被招募的蛋白直接融合表达,但这可能会影响正常的相分离过程。因此,作者在这里提出一种通过肽-肽相互作用将被招募者引入凝集体中的方法。
作者选择了一对高亲和力相互作用的短肽,RIDDRIAD。而用于与酶进行组装的相分离体系由三种骨架蛋白组成,GKAPShankHomer(它们是突触后致密区PSD中的主要蛋白,混合后可以发生相分离并自发形成凝集体)。
作者首先探究了引入多肽RIAD是否会对正常的相分离过程产生影响。通过融合表达构建RIAD-ShankRIAD-Homer,并与GKAP混合,获得了浑浊溶液。显微镜下可以观察到凝集体,超速离心分离沉淀相并进行SDS-PAGE也能够观察到大多数的骨架蛋白,如图1所示。以上的结果说明成功发生相分离,RIAD的融合几乎没有影响。

图1. RIAD融合后的相分离体系 (A)设计原理 (B)SDS-PAGE结果

随后作者通过RIDD-RIAD相互作用将蛋白引入到凝集体中。首先以单个蛋白EGFP-RIDD作为模型进行尝试。激光共聚焦显微镜的结果表明通过简单的混合,即可有效的将EGFP-RIDD引入到凝集体中,凝集体中的荧光信号比溶液中高出50倍。对凝集体中原有骨架蛋白的分析等也表明凝集体的正常性质没有受到被引入蛋白的影响。

进一步地,作者测试了凝集体中同时引入两种荧光蛋白,分别构建了CFP-RIDDYFP-RIDD。如图2B,可以观察到CFPYFP荧光信号的共定位,这说明一个凝集体中能够同时引入两种蛋白。通过荧光共振能量转移(FRET)的实验,如图2CCFP的荧光寿命在加入YFP后降低,表明凝集体中CFPYFP距离接近能够发生FRET反应。

图2. 凝集体中肽-肽相互作用驱动两种荧光蛋白的组装 (A)设计原理 (B)激光共聚焦显微镜 

(C)荧光共振能量转移测定供体荧光寿命

接下来作者将一个级联酶促反应体系引入至凝集体中。IdiIspA是萜类生物合成中关键的两个酶。分别构建Idi-RIDDRIDD-IspA,并通过Cy5荧光标记。作者构建了三个多酶催化系统,以比较有无肽-肽相互作用时的催化效率。结果如图3所示,两种酶在凝集体中得到显著富集;表观反应速率反映RIDD-RIAD相互作用使催化活性提高了50%


图3. 凝集体中萜类合成酶的组装促进催化 (A)三种酶体系示意图(B)激光共聚焦显微镜 (C)三种酶体系中初始产物生成速率

综上所述,在这项研究中,作者将能发生相分离的一些蛋白设计为支架,并通过设计的特异肽-肽相互作用驱动多种酶与凝集体的同时组装。文中的例子表明,通过这种物理组装将相分离体系与多酶催化结合,能够带来显著的富集效果与提高的催化活性。

作者:ZRC  审校:SJL

DOI: 10.1021/acs.biomac.0c00321

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.0c00321



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