on style="line-height: 1.75em; box-sizing: border-box;">▲第一作者：师玉婷、曹宇菲、程菊
论文DOI：10.1002/adfm.202111148
本文作者构建了一种级联催化释放NO抗细菌生物膜的纳米反应器，基于生物膜中的pH进行自激活响应，通过多酶级联催化反应，调高生物膜中的H2O2水平，从而为NO释放提供了条件。细菌感染作为世界上最严重的健康问题之一，由于其高发病率和高死亡率，引起了人们的广泛关注。更糟糕的是，细菌会粘附在生命体（如外科创面、鼻腔、泌尿道黏膜、肺组织或心内膜）和非生命体（如医疗设备、骨科内置物、内镜表面以及牙科陶瓷等）表面，进而繁殖、分化，并分泌一些多糖基质并将菌体群落包裹其中，最终形成生物膜。细菌一旦在伤口表面定植并形成生物膜，便可抵御宿主免疫系统的攻击和抗生素在生物被膜中的渗透，使细菌对抗生素的耐受性提高10-1000倍。从而引起临床上持续性的慢性感染等各种问题，这也是导致细菌性疾病难以根治的主要原因，对于一些囊性纤维化、癌症、烧伤等病患，细菌生物膜感染甚至可能带来致命威胁。一氧化氮（NO），作为明星信使分子，可以参与许多生理和病理活动特别是在抗细菌感染治疗领域，NO具有广谱抗菌活性，在生理过程中调节多种功能，已被证实能抑制生物膜的扩散以及触发免疫系统对感染的反应。但如何将NO气体按需、定点精准输送到细菌生物膜中，是科研人员关注以及亟需解决的科学问题。虽然胍基可在一氧化氮合成酶或H2O2存在的情况下，生产气体NO，但免疫细胞只能向细菌生物膜释放少量的H2O2，生物膜内低浓度H2O2，不能快速有效地刺激载药系统使其释放活性药物NO。因此选择性地提高生物膜内的H2O2水平，从而为抗生物膜活性药物提供释放条件一直存在巨大挑战。基于以上研究现状及面临的问题，兰州大学赵光辉团队设想是否能选择性地提高生物膜内的H2O2水平，从而为抗生物膜活性药物提供释放条件？为此，他们设计出了一种酶级联催化释放NO抗细菌生物膜的自激活纳米反应器。该纳米反应器由二茂铁/保护麦芽七糖 (Fc-AcMH) 和L-精氨酸修饰的β-环糊精 (Arg-CD) 两部分通过二茂铁和环糊精空腔主客体相互作用制备得到。此外，加入糖化酶（GA）和葡萄糖氧化酶（GOx）为酶级联催化反应提供了可能。所设计的前药纳米颗粒Arg-CD-AcMH+GOx/GA的“自激活级联抗生物膜”过程如下：前药纳米颗粒进入生物膜→生物膜中的弱酸环境触发→麦芽七糖被释放→糖化酶和葡萄糖氧化酶依次催化→生物膜中产生H2O2→H2O2氧化精氨酸的胍基产生NO→生物膜损伤和细菌凋亡。最终实验结果发表于Adv. Funct. Mater.（DOI: 10.1002/adfm.202111148），共同第一作者为兰州大学的师玉婷同学、曹宇菲同学和程菊老师，通讯作者为赵光辉副教授。如图1所示，当前药纳米颗粒到达细菌生物膜后，通过水合通道渗透到生物膜中，在生物膜的弱酸性(pH≈5-6)条件下，保护麦芽七糖缩醛键断裂释放麦芽七糖。释放的麦芽糖七糖被糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄糖进一步被葡萄糖氧化酶催化产生大量H2O2，H2O2氧化精氨酸中的胍基产生NO，诱导细菌生物膜破裂，细菌凋亡。▲图1：Arg-CD-AcMH+GOx/GA纳米反应器的制备及作用原理示意图
为了验证这个想法，作者分别检测了葡萄糖、H2O2和NO在体外的生成：用血糖仪监测不同pH条件下葡萄糖的释放，实验结果显示，与pH 7.4条件下的累积葡萄糖释放量相比，Arg-CD-AcMH+GOx/GA在pH 5.0条件下，累积葡萄糖释放量在1小时后显著增加，表明弱酸性条件确实能促进Arg-CD-AcMH+GOx/GA中缩醛键水解，并进一步在糖化酶作用下选择性地释放葡萄糖；通过过氧化氢试剂盒检测了不同pH条件下H2O2的释放，实验结果表明pH 5.5时H2O2累计释放量是pH 7.4时的三倍，说明自供给葡萄糖在很大程度上能选择性地提高生物膜内H2O2水平，进一步为胍基的氧化提供了有利的条件；最后通过Griess法检测了NO的释放，2 h内在pH 5.5时NO的最大生成量比pH 7.4时提高了3倍，说明NO的释放是可控的。▲图2：不同pH条件下，NO、H2O2和葡萄糖的体外释放
弱酸环境可以诱发纳米反应器生成NO杀死细菌，在不同pH条件下，研究了Arg-CD-AcMH和Arg-CD-AcMH+GOx/GA两种材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生物膜的抗菌性能。生物膜的结晶紫染色实验结果表明，pH 7.4时两种材料对细菌生物膜几乎没有造成损伤，而pH 5.5时Arg-CD-AcMH+GOx/GA组几乎看不到结晶紫的存在，证明Arg-CD-AcMH+GOx/GA对生物膜很好的分散作用。活死细菌染色也证明了pH 5.5时，Arg-CD-AcMH+GOx/GA具有良好的抗生物膜性能。▲图3：Arg-CD-AcMH+GOx/GA纳米反应器的抗生物膜性能
最后，作者进一步建立了大鼠皮肤生物膜感染模型，评价了纳米反应器对创面抗菌和愈合的实际促进作用。实验发现，随着治疗时间的增加，与对照组相比，经Arg-CD-AcMH+GOx/GA处理的小鼠感染创面逐渐形成疤痕，且愈合速度快于其他三组。定量分析结果表明，Arg-CD-AcMH+GOx/GA组感染创面面积在第12天下降到0.06 cm2，创面面积明显小于其他三组。而且从组织学分析结果可以看出，与其他三组相比，Arg-CD-AcMH+GOx/GA组炎性细胞更少，胶原蛋白沉积明显增多，同时Arg-CD-AcMH+GOx/GA的治疗还促进了更多新生血管生成。▲图4：Arg-CD-AcMH+GOx/GA纳米颗粒诱导大鼠皮肤感染伤口愈合性能
本文作者构建了一种级联催化释放NO抗细菌生物膜的纳米反应器，基于生物膜中的pH进行自激活响应，通过GA和GOx的级联催化反应，升高生物膜中H2O2水平，从而为NO释放提供了条件。本研究拓展了抗生物膜反应性给药系统的类型，为进一步开发新型的自激活控释系统提供了理论依据和制备经验。兰州大学赵光辉副教授团队长期致力于生物医用高分子和纳米材料的设计合成，围绕创伤修复和肿瘤的诊断治疗，重点开展软组织的创伤修复材料、止血材料以及药物输送研究。https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202111148
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