on style="white-space: normal; line-height: 1.75em; box-sizing: border-box;">通讯单位：美国德克萨斯大学奥斯汀分校、西北农林科技大学、中科院深圳先进技术研究院、中科院上海有机化学研究所、中国医学科学院药物研究所、厦门大学、北京中医药大学https://doi.org/10.1021/jacs.1c12010 在早期研究中，BlsE被认为是唯一已知的催化非氧化脱羧反应的{attr}3184{/attr}SAM酶。然而，美国德克萨斯大学奥斯汀分校刘鸿文教授研究团队对BlsE功能的重新表征发现，该酶实际上催化底物CGA的1,2-二醇脱水反应，该发现使得BlsE在杀稻瘟菌素S（Blasticidin S，BLS）生物合成中的角色更加明朗；同时，该研究结合化学生物学、结构生物学和理论计算研究详细揭示了BlsE催化脱水反应的分子机制。研究表明BlsE催化CGA发生脱水反应是通过分子内的质子传递产生4'-碳负离子进而脱去3'-羟基而完成的。该研究成果近日在线发表于《Journal of the American Chemical Society》上（https://doi.org/10.1021/jacs.1c12010），刘鸿文教授课题组的博士研究生李渝萱、中科院深圳先进技术研究院/中科院上海有机所周佳海教授课题组，來自西北农林科技大学/中科院上海有机所的博士研究生候雪丽、刘鸿文教授课题组访问学者/中国医学科学院药物研究所的陈日道博士为该文的共同第一作者，此外，厦门大学王斌舉教授的团队，西北农林科技大学高锦明教授，和北京中医药大学等单位的研究人员也共同参与了该项研究工作。自由基SAM酶（Radical SAM enzymes）是一类利用铁硫簇与S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）催化自由基转化的金属酶，目前该酶家族已经有超过50万个成员。在已被解析的天然产物生物合成途径中，许多复杂的反应均依赖于自由基SAM酶的催化，该类酶通过四铁四硫簇还原SAM使其5'碳-硫键均裂，进而产生高度活泼的5'-脱氧腺苷自由基（5'-dAdo·），该自由基可通过拔取底物上的氢原子生成底物自由基，从而引发包含烷基化、脱水、差向异构化或重排等多样的化学反应。BlsE：自由基SAM脱羧酶中的特例？生物合成中的真实角色？BlsE是BLS生物合成的关键酶之一，遗传敲除BLS生产菌基因组中该酶的编码基因会导致生物合成中间体CGA的累积。早期文献报道显示BlsE催化CGA结构中5'碳的中性脱羧反应生成CAP，然而该研究结果与BLS分子结构中仍保留有5'羧基的事实相悖。另一方面，尽管脱羧反应是自由基SAM酶催化的常见反应之一，但主要为氧化脱羧反应，即底物自由基在脱羧过程中经历单电子氧化达到淬灭，BlsE催化中性脱羧的行为显得极其罕见。为了探究BlsE是否是自由基SAM脱羧酶中的特例，刘鸿文教授课题组决定对该酶功能进行重新表征。刘教授课题组经过细致的研究分析发现，BlsE催化CGA生成的反应产物虽然显示出与CAP分子量相符合的质谱信号，但其NMR光谱数据表明该产物的真实结构是底物CGA发生脱水和脱羧反应后生成的化合物PPN。根据化学结构分析该产物的形成过程可能包含3'-羟基的离去以及4'-羰基的产生，虽然3', 4'-脱水反应常见于糖类化合物的生物合成，但这一转化将使CGA形成不稳定的β-酮酸结构（Pdt），因此，他们推测5'-脱羧可能是发生在酶催化脱水后的非酶促催化反应。为了验证该推测，作者通过提高反应中BlsE的浓度并缩短反应时间来累积BlsE的直接催化产物。在此反应条件下，他们观测到一个新产物的生成，该产物随时间延长降解为PPN，或可以被硼氢化钠还原生成CGA的3'-脱氧产物，从而证明了BlsE的催化产物是CGA脱水后的β-酮酸结构（Pdt）。换言之，BlsE并非催化CGA的非氧化脱羧反应，而是催化该化合物发生脱水反应。BlsE催化的脱水反应类似于刘鸿文教授课题组早期发现与表征的另外两个自由基SAM裂合酶：DesII和AprD4所催化的反应。他们因此推测BlsE的催化可能始于5'-脱氧腺苷自由基拔取底物上的4'-氢原子来形成底物自由基 (23)，而底物自由基可以通过以下两种机制达成脱水：（a）3'-羟基的1,2-迁移或（b）形成4'-碳负离子来脱去3'-羟基。为了验证这些假设，作者通过化学合成得到一系列同位素标记的CGA底物。通过质谱分析发现，以4'D-CGA为底物时可以在BlsE反应中检测到氘代-5'-脱氧腺苷的生成，从而验证了催化机制第一步对于拔氢原子区域选择性的假设。接着，他们以[3'-18O]-CGA为底物，观察到3'-羟基在BlsE催化中被离去，进而否定了3'-羟基迁移的假设（机制a）。由于氟原子与羟基大小类似，也可作为离去基团，但化学性质上更为缺电子且不能被去质子化，因此，氟代底物类似物常被用于酶催化分子机制的研究。刘教授课题组发现BlsE可以脱去3'-氟代CGA的氟，但不能离去4'-氟代CGA的氟。以上实验结果不仅支持机制b中描述的3'-羟基脱去，更显示CGA中4'-羟基可能提供质子以中和离去3'-羟基的强碱性。通过厦门大学王斌举教授课题组所进行的分子动力学（MD）模拟发现，机制b的活化能远低于a且与高活性5'-脱氧腺苷自由基的能量匹配，进一步支持了机制b的合理性。为了深入揭示BlsE催化的分子机制，刘教授课题组与中科院深圳先进技术研究院/中科院上海有机所周佳海教授课题组合作解析了BlsE的蛋白质晶体结构。结果显示BlsE的N末端为自由基SAM酶中常见的用以结合铁硫簇以及SAM的TIM桶状结构，而其C末端则为用以结合辅助簇的twitch结构域，表明BlsE与功能相近的AprD4在结构上并不相似。通过比较BlsE-SAM与BlsE-SAM-CGA共晶的三维结构，他们发现底物CGA的结合使BlsE由开放的构象转变为闭合的构象，推测主要由CGA中的5'-羧基的作用引起。此外，晶体结构分析显示底物CGA与活性位点中的数个亲水残基可能存在氢键作用，作者进一步通过定点突变实验验证了这些残基对保持BlsE催化活性的关键作用。然而，活性位点残基中并不包含明显的碱性残基，他们因此推测机制b中的碳负离子是通过4'-羟基与3'-羟基之间的分子内质子转移而非碱性蛋白残基对4'-羟基的去质子化而形成（机制c）。另外值得一提的是，BlsE为自由基SAM酶超家族中首个被表征的twitch家族裂合酶。在该研究中，刘鸿文教授研究团队对BlsE的功能进行了再表征，发现该酶实际上催化底物CGA的1,2-二醇脱水反应，修正了之前人们对BlsE功能的认知。作者与周佳海、王斌舉、高锦明合作，结合化学生物学、结构生物学和理论计算的系统研究，深入揭示了BlsE催化反应的分子机制。该研究表明BlsE催化CGA发生脱水反应是通过分子内的质子传递产生4'-碳负离子进而脱去3'-羟基而完成的，而由于所生成的β-酮酸产物的不稳定性，该产物容易进一步发生非酶促催化的脱羧反应，这一发现解释了早期文献报道中观察到脱羧反应的原因。虽然BlsE催化生成的β-酮酸产物并不稳定，但此中间体可能在生物体内有效地被下游的生物合成酶所利用，从而完成BLS的生物合成，该推测的验证还有待开展进一步的深入研究。刘鸿文（Hung-wen Liu）教授，为美国德克萨斯大学奥斯汀分校（University of Texas at Austin）药学院化学生物学和药物化学系以及自然科学学院化学系教授。刘教授团队的研究兴趣在于化学和生物学交叉学科的重要科学问题，近年来主要致力于阐明重要天然产物生物合成酶的催化机制，包括生物合成中涉及的自由基转化与碳-碳键生成的详细机制。其团队在国际著名学术杂志Nature、Science、J. Am. Chem. Soc.、Chem. Review、Angew. Chem. Int. Ed.发表了多项具有重要影响力的研究成果。代表性成果包括，（1）解析了临床上应用的重要抗生素磷霉素（fosfomycin）的生物合成机制（Nature 2005, 437, 838）；（2）系统阐明了天然产物分子中不种类型的糖基单元的生物合成（Nature 2007, 446, 1008）；（3）发现了自然界中首个在体外单独催化[4+2]环加成反应的参与多杀菌素A（spinosyn A）生物合成的环化酶，解析了其蛋白结构并阐明了其催化[4+2]环加成反应的分子机制（Nature 2011, 473, 109； Nat. Chem. Biol. 2015, 11, 256）。刘鸿文教授曾担任美国化学学会期刊Organic Letter副主编，并获颁中央研究院院士、美国微生物学会、美国先进科学学会、美国化学学会与日本科学促进会会士，以及Claude D. Hudson Award、Repligen Award、Horace S. Isbell Award、Nakanishi Prize、Arthur C. Cope Scholars Award、Norman R. Farnsworth Award, 等学术奖项以表彰其在醣化学、生物化学与有机化学研究领域所做出的贡献。(https://sites.utexas.edu/liu/)https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c12010
目前评论：0