分享一篇最近发布在预印本上的文章，Phase-separation propensity of non-ionic amino acids in peptide-based complex coacervation systems。这篇文章的通讯作者是来自日本国立先进工业科学技术研究院的Shunsuke Tomita教授。

蛋白质的液液相分离(LLPS)在活细胞内的动态划分中起着重要作用，并且它也是地球原始生命阶段原始细胞出现的关键热力学过程，因此对于它的研究受到了广泛的关注。LLPS的过程会形成小体积的分子凝聚相（即所谓的液滴），这些液滴富含水，但不同于水凝胶，液滴内通常是致密的粘弹性液体（水含量40-90%，粘度0.1-100 Pa·s）。这些特征使它们能对周围环境（如温度、pH值和离子强度）实现快速、适应性和可逆地响应。此外，由于缺乏膜结构，液液相分离允许某些低分子量或高分子量的分子有选择地掺入到液滴内部，从而有助于生物反应的时空控制。

生物液滴主要由蛋白质、DNA或RNA等生物大分子组成，其中蛋白质中的天然无序序列被认为在LLPS中起到了重要的作用。这些LLPS过程是由多价缔合作用驱动的，尤其是静电相互作用、π-π堆积和阳离子-π相互作用。现在已经有模型来预测蛋白质的液液相分离行为，一个代表性的例子是Stickers-and-spacers model，这个模型认为具有相互作用的粘性残基被可溶性的间隔残基分开后，可以形成液滴而不是固体聚集物。

但到目前为止，尽管疏水残基在蛋白质折叠中起着关键作用，人们对于非带电氨基酸残基在LLPS中所起到的作用认识甚少。在本文中，作者建立了一个用正电荷多肽与核酸之间的静电相互作用形成LLPS的模型体系，通过在多肽上引入非离子型氨基酸来研究这些氨基酸对形成LLPS的影响。

图1. 多肽/DNA液液相分离体系用于研究非离子型氨基酸对相分离的贡献

作者设计了12种多肽K7X3，每种多肽由N段7个赖氨酸和3个非离子型重复氨基酸组成。作者将这些多肽与单链DNA (dA15)复合，来研究非离子型氨基酸对LLPS的影响。这些多肽在溶液中的二级结构均为无规卷曲，因此可以忽略高级结构对LLPS的影响。

K7G3和dA15的相图表明（图1b），在pH = 7的50 mM HEPES缓冲液和10%聚乙二醇 (PEG) 的存在下，在K7G3浓度高于40 μM和特定的dA15浓度范围内，才会形成液滴状凝聚物。在这些浓度范围内，作者未观察到固态聚集体。不仅K7G3，K7X3多肽与dA15在等电荷比时均可形成液滴状凝聚体。延时图像证明了相邻两个液滴之间可以发生融合，并且作者用光漂白后荧光恢复(FRAP)实验进一步证实液滴内分子的流动性（图2b,c）。作者认为可以通过确定产生液滴时的最低多肽浓度，并将这些值与K7G3比较，从而定量评价氨基酸的贡献。

图2. 非离子型氨基酸在与ssDNA形成液滴中的作用。(a) K7X3/dA15正负电荷比为1.0的明场显微图。(b) K7G3/dA15液滴的聚集。(c) 光漂白荧光恢复(FRAP)实验。(d) 比浊度滴定实验。(e) 由图d得到的临界电荷比C_crit。

为了量化K7上的三肽X3对LLPS的影响，作者用dA15溶液滴定K7X3，监测溶液的比浊度（图2d），将浊度开始增加时的电荷比定义为临界电荷比C_crit，较小的C_crit表明诱导LLPS所需的肽浓度较低。由图2e可知，具有芳环的氨基酸可以非常有效地诱导LLPS，而疏水性较强的脂肪族氨基酸相对不容易诱导LLPS。

作者发现，在排除芳香族氨基酸时，C_crit与氨基酸残基的亲疏水性成正相关，即疏水性越高，越不容易诱导LLPS（图3）。这可能是由于疏水侧链越大，有效溶剂化体积会增加，使相分离状态不稳定。

图3. K7X3/dA15溶液的C_crit值与氨基酸参数的拟合与比较

作者使用其他种类DNA链验证该结果的普适性，结果表明这些多肽在与核酸复合时均有类似的趋势，即芳香族氨基酸特别容易诱导LLPS，但疏水性大的脂肪族氨基酸相对会抑制LLPS。芳香族氨基酸能够有效诱导LLPS的原因在于其能与碱基发生π-π堆积作用，因此增加了多价的相互作用。作者用聚甲基丙烯酸代替核酸做了相同的实验，与甘氨酸相比，色氨酸和苯丙氨酸会对LLPS产生抑制。

总的来说，在这篇文章中，作者建立一个利用多肽和核酸复合形成LLPS的模型体系，并利用该模型发现：1. 非离子氨基酸会抑制LLPS，并且随着侧链疏水性的增加，抑制作用会增强；2. 疏水性芳香氨基酸不遵循这一规律，反而促进了LLPS，这是由于芳香氨基酸与核酸碱基之间的的芳香基团π-π相互作用。该工作有助于我们理解并预测生物体内LLPS现象，并对无膜细胞的设计提供指导。

作者：ZHS    审校：ZRC

DOI: 10.26434/chemrxiv-2022-5x360

Link: https://chemrxiv.org/engage/chemrxiv/article-details/624ae7095ab8df61878a18ac