变型链球菌（S. mutans）是引起龋齿的主要口腔微生物，Mutanobactins（MUBs）是S. mutans UA159产生的脂肽类化合物，具有新颖的大环和七元硫氮杂环结构。本文研究表明，MubD-R结构域通过将脂肽链从蛋白上释放并将其还原为末端带有醛基的脂肽后，引发了顺序的三步反应：C-C和C-S键的形成以及C-C键的断裂。自发的羟醛缩合形成C-C大环后，通过巯基的亲核进攻形成C-S键，接着通过retro-aldol反应将C-C键断裂，从而形成不同的MUBs类化合物。

Figure 1. MUBs及其衍生物的结构

前期的研究中对MUBs的生物合成过程进行了推测，首先癸酸装载在MubE的酰基转运蛋白（ACP）结构域上进行起始，然后经过一步聚酮合酶（PKS）和六步非核糖体肽合成酶（NRPS）共七步的催化延伸，得到装载在肽酰载体蛋白（PCP）上含有β-羰基的十二烷基六肽（Figure 2）。到目前为止，脂肽链的释放机制仍旧不清楚，这也导致无法清楚地阐释随后的大环环化以及其他后修饰的机制。本文的研究表明，MubD-R通过将脂肽链从蛋白上释放并将其还原为末端带有醛基的脂肽后，引发了顺序的三步反应：C-C和C-S键的形成以及C-C键的断裂，从而形成丰富多样的MUBs类化合物。

Figure 2. 推测MUBs 类化合物的生物合成途径。阴影部分为非酶催化的反应。

对MUBs类化合物的生物合成基因簇进行生物信息学分析，发现两个基因（mub T、mub D-R ）可能负责大环环化和链释放。首先通过同框缺失mub T基因，对突变株的发酵液进行分析，发现MUBs类化合物仍然存在，只是产量低于野生型菌株，说明mub T是一个type II的TE，起着纠错的功能，不负责链从蛋白上释放。

为了确认MubD-R是否参与了链的释放和大环环化，作者表达了N-His₆-tagged MubD-R (N-MubD-R) 以及连有PCP的MubD-R (N-MubD-TR)，同时化学合成了化合物4的线性前体模拟底物β-keto lauryl hexapeptide-SNAC（10）。以10为底物，分别以NADPH以及NADH作为辅因子进行了MubD-R催化的生化反应，成功检测到了MUB D（化合物4）的生成。但是在以N-MubD-R或NADH进行反应时，化合物4的产生量较低（Figure 3A）。结果表明MubD-R利用NADPH作为辅因子催化线性酰基前体从酰基载体蛋白上还原释放，生成C-C大环化合物。

一般认为PKS或者NRPS的C端R结构域并没有催化C-C键形成大环的功能，我们推测可能是由于MUBs中存在β羰基，促使了C-C大环的形成。为了能够拆开还原和环化两步反应，作者合成了没有β羰基的线性模拟底物butyryl hexapeptide-SNAC（11）。以11为底物以NADPH为辅因子进行了MubD-R催化的酶学反应，成功得到了末端被还原为醛基的线性产物（12）（Figure 3B）。上述实验结果表明：MubD-R能够催化线性酰基前体从酰基载体蛋白上还原释放(还原酶功能)，生成末端为醛基的线性脂肽。

Figure 3. LC-MS检测MubD-R以10和11为底物的酶学反应

由于具有很强亲电子的醛基存在，使得MUBs类化合物的C2能够很容易的通过羟醛缩合形成C-C大环，为了验证C-C键是由MubD-R催化形成还是通过自发的羟醛缩合形成，作者合成了化合物4的线性前体13，通过添加不同酶量进行反应，发现线性肽醛前体13能够自发的形成4，而不受酶量的影响。说明MubD-R通过将脂肽链还原为末端为醛基的线性化合物后，引发了自发的C-C大环环化。

S.mutans 中分离到的天然产物1-3，除了含有大环结构外，都含有1,4-硫氮杂七元环。化合物4中不含巯基，因而无法形成1,4-硫氮杂七元环。为了验证其他含有七元杂环的MubBs类化合物中C-S键的形成以及C-C大环和C-S键形成的先后顺序，作者以13为底物通过引入含有巯基的半胱氨酸进行反应，通过LC-MS检测生成的化合物，发现此反应中出现了3个随反应时间先后顺序而产生的新化合物（4、15和16）。结果表明，首先13在很短的时间内通过自发的羟醛缩合形成了4，接着半胱氨酸的巯基亲核进攻4的C3位，在半小时内通过C-S键的形成转变为15，15并不稳定会通过C-C键的断裂转变为16（Figure 4）。因此，我们认为C-C大环形成先于C-S键的形成，C-C键的断裂发生在二者之后。

Figure 4. 化合物13与半胱氨酸的自发反应

为了验证是否只要含有亲核基团巯基就可以发生类似的反应，以及是否可以在形成大环后继续进行反应，作者通过向4中加入N-乙酰基半胱胺（SNAC）进行反应，检测到了18和19。推测1-3以及5-9可能也是由20和21通过顺序的形成C-C键以及C-S键产生的，最后通过C-C的断裂产生6和7。为了验证在形成1,4-硫氮杂七元环后能否发生C-C键的断裂，作者将2置于PBS缓冲液中，在37 ^oC下过夜，通过LC-MS检测到了C-C键断裂的7生成，从而证明了在形成1,4-硫氮杂七元环后能够发生C-C键的断裂。

在许多临床上重要的药物中已经观察到由大环环化产生的多种分子结构。相较于C-O和C-N键，C-C键形成的大环十分少见，并且C-C大环通常都是通过氧化或者亲核取代反应形成的，而本文的研究发现了在MUBs中通过将脂肽链末端还原为醛基引发了羟醛缩合形成C-C键大环。通过类似方法形成大环的还有lankacidin和anatoxin，但是它们中的亚胺基团是通过氧化反应得到的，并且其大环的形成机制到目前为止依旧没有在体外进行阐释。

在MUBs生物合成中羟醛缩合形成C-C大环后，巯基可以通过亲核进攻C3形成C-S键，从而形成1,4-硫氮杂七元环，而在有机合成中也是通过类似的两步反应形成β-硫代二酮类化合物。本文的研究展示了S.mutans在人类口腔中利用了有机合成中的方法产生MUBs以及mutanolins。而且S.mutans可以进一步的通过retro-aldol reaction进行C-C键断裂形成半缩硫醛，在此之前的报道较为少见，这又为有机合成提供了借鉴。

本文的研究表明，MubD-R通过将脂肽链从蛋白上释放并将其还原为末端带有醛基的脂肽后，引发了顺序的三步反应：C-C和C-S键的形成以及C-C的断裂。自发的羟醛缩合形成大环后，C3位可以被巯基亲核进攻形成C-S键，形成不同硫氮杂七元环的mubtanobactins类化合物，同时为寻找更多的mubtanobactins衍生物提供线索，从而阐释为什么该类化合物的合成基因簇mub对变形链球菌的抗氧化作用非常重要。