为大家分享一篇发表在J. Am. Soc. Mass Spectrom.上的文章，Tutorial: Chemistry of Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry¹，该文章的通讯作者是来自美国ExSAR公司的Yoshitomo Hamuro教授。

氢氘交换质谱（HDX-MS）是一种描述蛋白质动力学的强大方法，主要应用于研究蛋白质表征、工艺优化、蛋白质突变的结构效应、蛋白质-蛋白质/小分子相互作用等，酶学、质谱技术和数据处理方法的进步使HDX-MS能够实现更高的分辨率。本研究着重于分析HDX-MS的化学过程，前半部分使用pKa值和质子转移理论推导了蛋白质中各个官能团的HDX速率，后半部分描述了影响主链酰胺氢交换速率的各种参数。

一、各官能团的HDX速率

on style="white-space: normal; text-indent: 2em;">作者首先根据质子转移理论推导出两个官能团之间的质子转移反应的二级速率常数k_T可以表示为速率常数k_D和ΔpKa（质子供体的pKa-质子受体的pKa）（公式1）。

氢氘交换反应由氢转移反应和氘转移反应组成，酸催化过程中先在目标官能团上加一个氘，再去除一个氢质子，碱催化过程中先在目标官能团上去除一个氢质子后再加氘，氘水催化的过程则都有可能。根据公式1一旦确定了二阶速率常数且只考虑以上三种催化时，可以通过公式2获得一阶HDX反应速率常数k_ch。其中在较低pH下，由于氨基质子化，应考虑到来自氨基的质子或氘转移反应；在较高pH下，由于去质子化，羧基等官能团对或氘转移反应影响不大。

接着，作者用质子转移理论估计了羟基、巯基、酚羟基、氨基、咪唑基、羧基、胍基、吲哚基团的HDX速率，并与实际观测数据进行了比较（图2）。

公式3. 根据Linderstrøm−Lang模型推导出的EX1、EX2模型中交换速率常数公式，其中K_app为观察到的交换速率，K_op为蛋白质结构打开常数，k_ch为化学氢氘交换速率。

公式4. 用吉布斯自由能ΔG_op表示打开常数K_op。

侧链、pH和温度会影响HDX过程。侧链效应对EX2时计算自由能ΔG_op具有很大影响，通常酰胺的C端侧链比N端侧链的作用稍强；庞大的疏水氨基酸（如Ile、Val和Leu）会降低HDX速率，也会更好的保护氘不被交换回去；极性氨基酸（如Cys、His、Asn和Ser）会加快HDX速率，但在回交时不能很好地保护氘，尤其当夹在两个His残基之间时。对此，Englander, S.W等人的最新成果提供了软件来计算侧链效应²。

N、C末端对解析HDX-MS数据以实现高分辨率十分重要，由于主链酰胺氢在淬灭时会以各自的速率失去氘，当蛋白被酶解为肽段时会引入许多新的N、C末端以及不同的回交率。最明显的末端效应是在淬灭条件下，肽的第一个酰胺氢的交换速度明显快于其余的主链酰胺氢，故通常假定肽的第一酰胺在淬灭过程中不保留氘，当N端氨去质子化时这种N端效应消失。但是当前两个残基中的一个或两个是大分子氨基酸（如Ile，Val和Leu）时，第一个酰胺上的氘不可忽略。与N末端相反，C末端的羧酸根基团使碱催化的氢交换反应减速，肽的最后一个酰胺氢的交换可能比其余主链酰胺氢的交换慢，当最后两个残基包括His、Asp、Cys、Gly、Glu、Ser和Glu时，可能会突出此影响。

pH影响HDX分析的各个方面，因为主链酰胺氢化学交换反应主要是酸或碱催化反应。溶剂影响主要在LC分离过程中突显出，添加有机溶剂后，碱催化反应的二级氢交换速率可能不会发生太大变化，酸催化反应的二级氢交换速率可能会略有变化，但由于反应机理复杂，很难在添加有机溶剂时精确估算。氢同位素的类型也会对主链酰胺氢交换速率有轻微影响（图3）。

综上，本文介绍了用于蛋白质的氢氘交换质谱所涉及的化学内容。首先使用质子转移理论和pKa值估算了蛋白质中所有类型的杂原子氢的速率，估算的HDX速率与大多数官能团的观测值非常吻合（吲哚和酰胺基除外，差异由反应机理解释）。其次讨论了影响主链酰胺氢HDX速率的因素，包括侧链、N/C末端、pH、温度、有机溶剂和同位素，这些因素对正确设计交换反应和下游过程，以及对HDX-MS数据的分析和解释十分重要。

文章引用：Hamuro,Y., Tutorial: Chemistry of Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Society for MassSpectrometry 2021, 32 (1), 133-151.