介绍最近发表在Nature Review Chemistry上的一篇关于生物正交反应的综述，作者是来自University of California, Irvine的Jennifer A.Prescher教授。

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生物正交化学使研究人员能够研究生命系统中的生物分子。这些反应具有很高的选择性和生物相容性，可以在许多复杂的环境中进行。但是，就像任何有机转化一样，没有完美的生物正交反应。为所需的应用选择“最合适”的反应至关重要。因此，必须有多种化学试剂可供选择，提供各种功能比如不同的反应速率。在过去的几年中，不仅在扩大生物正交化学的数量上，而且在为特定应用微调现有反应性方面取得了长足的进步。在这篇评论中，我们着重介绍生物正交反应开发的最新进展，重点是物理有机化学原理如何带领探针设计。这些化学工具的不断扩展将提供精确调整过的试剂，并用于在不同的环境中操纵形成化学键。

如果要全面了解生命系统，就需要使用工具和方法来探测其自然条件中的生物分子，长期以来人们一直使用荧光蛋白和其他遗传标签实现这种目的。尽管功能强大，但这些工具不适合直接监视非蛋白质目标，包括小分子代谢物。对更具通用性的平台的需求刺激了生物正交化学-高度选择性反应的发展，该反应可用于共价标记活细胞以及某些情况下的活生物体中的靶标。数十年来，生物正交反应已用于可视化和分析各种生物分子。这些研究为细胞和有机体生物学的各个方面提供了基本的知识。此类研究还揭示了生物正交工具包的局限性，启发了更多对探针反应性和选择性的微调开发。

生物正交化学的所有应用的核心是具有化学选择性，并与生物系统相容的反应性。此类反应的发展可能很困难。溶剂和温度是固定的，反应必须在多种干扰官能团之间进行。通常不能仅仅通过加热受体或添加更多试剂来加速反应。因此，用于微调圆底烧瓶中化学反应的方法通常无法用于生理环境，在该环境中几乎无法更改任何参数。尽管如此，几代化学家一直在努力控制活细胞和生物体中的键形成。他们的努力提供了可以在不损害生命系统的情况下执行的反应。

这篇综述评估了生物正交反应的发展，并着重于机械论如何推动该领域的发展。像其他化学领域一样，不存在“万用”（指可以通用于所有情况）的反应。相反，每个反应都有其优点和缺点，其局限性继续推动着新的进步。在第一部分中，我们提供了生物正交化学的简要历史，并介绍了早期探针开发的常见策略。然后，本综述的大部分内容展示了生物正交反应设计的最新成就。我们还着重介绍了可同时用于多组分标记的生物正交化学的工作。这些以及其他创新将继续扩大生物相容性和相互正交的试剂的范围。

经典的生物正交变换

化学家依靠强大而通用的反应来制备复杂的分子。拟定合成路线时要考虑到试剂的可得性，产率和选择性。理想情况下，反应应该速率快，选择性好，同时适用于多种底物。实际上，大多数反应不是普遍有效的，需要在不同情况下对温度，pH或化学计量进行调整。催化剂和溶剂的种类也多种多样，以优化收率。反应范围的限制通常成为新转化的关键。发现反应和改进反应的这种反复循环提供了在各种情况下控制键形成的纲要方法。在某些情况下，已经开发了成百上千的专门试剂来解决反应范围的缺陷。

考虑到某些因素，迭代优化也已用于调整用于生命系统的试剂（图一）。正交生物官能团必须在动力学和代谢上稳定，但在生理条件下必须与互补探针快速反应。反应还必须耐受水和其他生物官能团。细胞和组织中的限制也排除了许多有机反应。几种生物学应用也需要试剂的空间“足迹“尽可能的小。因此，开发小体积的化学试剂是另一个重要目标。

图1 | 将反应从圆底烧瓶转移到生物系统。细胞和组织中使用的反应物（橙色球和弧）必须与细胞功能兼容。具有挑战性的应用继续推动着生物正交反应的发展。尽管在烧瓶中易于控制的变量在活体系统中通常是不变的，但在烧瓶或细胞中的优化都遵循相似的原理。

那么，我们从哪里开始呢？寻找异源生物中不常见的官能团是一个很好的起点。微生物，植物和其他物种通常可以使用哺乳动物细胞中不存在的化学和功能。这些基本单元可以在生物环境中生存，并且与哺乳动物系统立即正交，从而使其成为生物正交化学的有吸引力的候选对象。一个典型的例子是炔烃，它存在于许多微生物代谢产物中，而在高级真核生物中却不存在。炔已在许多环境中被用作生物正交基本单元。流行的生物正交官能团还包括一些来自于合成化学的不太讨喜的候选物。传统上，有机叠氮化物和张力炔烃对于在生物系统中使用而言过于不稳定，但是经过细微的调整后，已经成为本领域公认的标准试剂。这些示例为后续试剂开发提供了重要的经验。在本节中，我们简要介绍一些看似“不合适”的官能团如何成为生物正交化学的两种最常见类别的基础：极性反应和环加成（图二）。我们重点介绍了这些探针开发的早期障碍和关键进展，这些初步成功为试剂的持续改进提供了路线图。

图2 | 调整反应以用于生物应用。 生物正交化学主要分为两类：极性反应（A部分）和环加成反应（B部分）。显示了限制（以红色突出显示）如何刺激新反应（以绿色突出显示）的发展的示例。

极性反应

醛和酮是最早用作生物正交标记的试剂。对生物分子标记来说，这些羰基由于小尺寸和在生物系统中的相容性而具有吸引力。而且，这些亲电试剂还容易与α-亲核试剂如酰肼和氨氧基缩合（图二Ab）。醛和酮的缩合反应已用于标记多种生物分子。然而，该反应对pH敏感，并且在生理环境中相当慢。苯胺催化剂可以提高反应速率，但是在细胞环境中反应仍然很难进行。

尽管醛和酮在细胞中的使用较少，但只有少数其他生物正交官能团可与它们的最小尺寸相媲美。其中最具影响力的是有机叠氮化物。该官能团是非生物的，仅包含三个原子。叠氮化物在生物环境中非常惰性，但具有独特的反应活性。例如，它们可以与软亲核试剂反应，包括三芳基膦（通过Staudinger还原反应）。该反应通过氮杂-叶立德中间体进行，该中间体可被相邻的亲电试剂捕获。Bertozzi及其同事利用此功能，在膦上安装了一种酯，以捕获氮杂叶立德（图二Ad）。反应最终通过酰胺键将两种反应物连接起来。这种变体（称为施陶丁格连接法）适合在各种复杂环境（包括活细胞）中标记叠氮化物。早期的亮点应用是多糖和蛋白质翻译后修饰，此后还靶向了许多其他生物分子。施陶丁格连接法也是用于活体啮齿动物的第一个此类反应，这是一种特别苛刻的环境。

施陶丁格连接的多功能性推动了反应发展的整个领域。许多早期研究的目的是提高链接反应的速率。尽管施陶丁格的连接牢固到足以在体内标记多糖和其他生物分子，但缓慢的反应速率却对啮齿动物和高等生物的影像学研究具有挑战性。需要大量试剂可以以在合理的时间尺度上驱动共价键的形成，但由于许多膦探针的水溶性有限，因此这样的浓度并不容易实现。这些缺点通常使施陶丁格连接在体内的应用受限，但其启发了有机叠氮化物的其他类型的转化。

环加成。

环加成因其出色的化学选择性而成为流行的生物正交反应（图二Ba）。最早利用的方法之一是[3 + 2]与叠氮化物的环加成反应。除了是温和的亲电子试剂外，有机叠氮化物是1，3-偶极子，可与炔烃反应。由于炔烃在高级真核生物中很少见，因此它们是正交的。然而，叠氮化物-炔烃环加成通常需要高温或高压，以及与生物不相容的条件。一个关键的突破是发现可以使用一价铜加速环加成反应（图二Bb）。铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应（CuAAC）在化学生物学和其他学科中无处不在，并且仍在激发新的应用。一价铜的细胞毒性阻止了其在体内的应用，因此人们开发出许多生物友好的催化剂。其中许多水溶性配体具有可稳定一价铜并防止活性氧物种形成的功能。尤其是，聚三氮唑配体使CuAAC反应能够在活细胞和斑马鱼中进行。

铜催化剂带来的限制也启发了化学家设计新的方法来连接1,3-偶极子。最有效的方法之一是依靠张力能使炔烃从其正常的线性几何形状弯曲。发现在不存在铜催化剂的情况下，环辛炔是可与叠氮化物反应的最小的稳定环炔烃。这项工作引出了张力促进的叠氮化物-炔烃环加成（SPAACs）的整个系列（图二Bc）。此类反应已广泛用于复杂的生物环境中，包括植物，秀丽隐杆线虫和小鼠。尽管SPAACs反应可最大程度地降低在生物系统中的毒性，但某些炔烃会与生物硫醇反应。而且，在反应性最强的张力炔烃上观察到最快的反应速度约为1 M-1s-1，这不适用于某些体内应用。

为了兼顾反应速度和生物相容性的需求，化学家已经开发了其他环加成物。一类值得注意的是包括逆电子需求的Diels-Alder（IEDDA）环加成反应（图二Bd）。四嗪与反式环辛烯（TCO）之间的IEDDA反应尤为突出（图二Be）。这对之间的反应速度比最活跃的SPAACs对快106倍。由于仅需要少量物质来驱动共价键形成，因此这种快速转化已在细胞和生物中广泛使用。四嗪-TCO环加成反应的有利动力学特征使得科学家能够探索新的体内影像学平台，包括正电子发射断层扫描和其他方式。四嗪-TCO反应也已广泛用于标记生物分子，释放前药和激活酶，

调整生物正交反应

尽管在过去的二十年中，科学家在生物正交反应设计方面取得了令人瞩目的成就，但局限性仍然存在。许多试剂在最苛刻的生物学环境中使用时不够稳定，或者在体内应用中反应缓慢。而且，尽管许多反应在单个目标上都能很好地起作用，但是由于存在交叉反应性问题，大多数不能组合使用来标记多个目标。因此，同时追踪多种生物分子仍然是一个长期的挑战。总而言之，这些局限性表明了不仅需要开发新的反应，而且还需要对现有的化学物质进行微调。下一节将重点介绍解决填补生物正交工具中的空白和扩大反应性多样性的最新方法（图二）。

调整极性试剂和反应。

如上所述，一些最早的生物正交转化涉及羰基和α-亲核试剂的缩合反应。这些反应的可逆性给生物分子标记带来了挑战。科学家已经努力建立更稳定的加合物，包括使用临位稳定基团。一个重要的例子是硼酸（图二Ac）。这些官能团可以协助例如腙和肟形成加合物，并防止水解。硼酸还被用来稳定由其他α-亲核试剂形成的连接加合物，以及标记肽和小蛋白上的N端半胱氨酸残基。

与叠氮化物的极性反应也已针对特定应用进行了调整。施陶丁格连接是早期的优化目标，其工作重点是提高反应速率和试剂溶解度。在叠氮化物上引入吸电子基团或在膦上引入给电子基团可提高连接速度。例如，具有氟和氯取代基的缺电子芳基叠氮化物的速率比未取代的芳基叠氮化物的速率更快。有趣的是，在这些情况下形成的氮杂-内酰胺是稳定的加合物，无需利用膦形成亲电子陷阱。此后，卤代芳基叠氮化物已被用于标记活细胞中的多糖和蛋白质，合成适合于施陶丁格连接的富电子膦并不那么简单，更多的亲核骨架可以减少蛋白质中的二硫键并易于快速氧化。出于这种目的，许多膦探针已针对细胞和其他应用进行了调整。

为了提高生物相容性，还对膦试剂进行了调整。例如，Ren等人合成的包含氟磺酸酯的膦（图二Ae）。这种处理方式类似于原始的施陶丁格连接中利用酯捕获氮杂-叶立德。在水解并排出氟化物后，该连接产生了氨基磺酸酯。与最初的施陶丁格连接探针相比，改性的膦在水溶性上得到显著改善，氨基磺酸酯产品还可以模拟许多生物分子和代谢物中存在的磷酸骨架。

科学家还调整了完全不同的磷亲核试剂的叠氮化物连接。例如，磷酸酯和亚膦酸酯与芳基叠氮化物反应以分别提供氨基磷酸酯和氨基亚膦酸酯加合物。这些反应可用于通过多种探针选择性修饰蛋白质和其他生物分子。

调整的膦也已在其他化学领域得到开发。例如，膦可以与迈克尔受体反应并形成稳定的磷加合物。这种反应已被用于标记生物分子。例如，三（2-羧乙基）膦（一种广泛用于生物学的水溶性还原剂）与缺电子的烯烃反应。该反应用于研究活细胞中的蛋白质糖基化和组蛋白上的巴豆酰化。

环磷烯酮衍生物（CpX，其中X为O，S或Et2N+）是膦连接试剂中的最新成员。当X 为氧时，连接先经过基础的迈克尔加成反应，然后开环形成活性乙烯酮-内酯（图三）。该乙烯酮可被膦上的邻位亲核试剂捕获，从而提供α，β-不饱和羰基。由于单取代的CpOs易于与生物学上相关的硫醇反应，所以已发展了许多具有双取代官能团的生物惰性骨架。这些最新的试剂可用于活细胞。

图3丨环丙烯酮衍生物的反应性 环丙烯酮（CpX）衍生物表现出独特的反应活性，具有氧或硫原子（分别为CpO和CpS）的类似物通过乙烯酮-叶立德中间体与膦反应。相比之下，含氮骨架（CpN+）反应形成含膦双环。

CpOs的反应性可以通过杂原子置换来进一步调节，这是在生物正交化学中调整探针的常用策略。CpO的硫变体，环丙烯硫酮（CpS）也可以通过硫代乙烯-叶立德中间体与膦快速反应， 硫羰基类物质是研究蛋白稳定性和功能的生物物理学探针。还已经探索了CpO的氮杂类似物，有趣的是，环丙铵（CpN+）离子作为生物正交试剂，CpN +离子通过与CpO或CpS衍生物不同的机理与膦反应。先通过迈克尔加成反应生成烯胺，该烯胺经过质子转移而不是开环生成含磷双环（图三）。因此，核心骨架的微小变化会对反应性产生深远影响。

调整偶极子用于生物正交环加成

叠氮化物-炔烃环加成反应仍然是用于检验生物系统的最流行的1,3-偶极环加成反应之一。这个成功的连接为探索新的1,3-偶极子提供了灵感。这类化合物包括“硝酮”（图四a），它比叠氮化物与某些炔烃反应更快。类似于叠氮炔烃加成，硝酮炔烃环加成反应也可以经由铜催化。这些反应已用于成像糖代谢和受体-哺乳动物细胞中的配体相互作用以及细菌中的肽聚糖结构。

生物正交偶极子集的另一个新面孔是悉尼酮（sydnone）。该1，3-偶极炔烃反应生成吡唑加合物。尽管最初的应用需要铜催化，但随后的工作发现化合物也能够与张力炔烃进行无铜反应。悉尼酮可以通过修饰以调节其在生物学应用中的反应性。例如，氯取代的悉尼酮与常见的张力炔烃，双环[6.1.0]壬炔（BCN）的反应速率提高了30倍。氟取代进一步提高了悉尼酮与各种张力炔烃的反应速率

重氮化合物，一种有机叠氮化物的近亲也已被类似地调整为偶极子，并用于生物正交应用。重氮基团的小尺寸在生物分子标记具有吸引力，但长期以来人们一直认为此类官能团对于细胞而言反应性太强。但是，重氮官能团与芳基类或吸电子基团（例如酯或酰胺）结合时是稳定的。重氮化合物与张力炔烃的反应速率数倍于相应的叠氮化类似物反应。重氮-环辛炔反应已用于标记细胞的多糖以及其他靶标。重要的是，所得吡唑加合物对几种生物亲核试剂稳定。此外，这类重氮物已提供了与非环缺电子烯烃反应的骨架，可以在叠氮化物存在下进行的反应。

更具反应性的1,3-偶极子也已被用于生物正交应用。反应物被隐藏，直到施加了外部触发（通常是光），才能使反应物按需释放。腈亚胺（Nitrile imines）就是这类偶极子， 它与张力烯烃（如降冰片烯和环丙烯）发生强烈反应，但在没有连接目标的情况下会快速水解。可以将腈亚胺锁住以获得在生物环境中更稳定的官能团，例如四唑或悉尼酮，然后使用紫外线照射来释放活性物种。可以针对不同波长的光调控起始四唑发色团的光解作用（即腈亚胺释放）。这种新增的控制方法激发了对其他“光点击”反应的探索，以扩大生物正交化学的研究范围。腈亚胺还通过电子和位阻修饰得到了广泛的修饰。

为生物正交环加成而调控亲偶极子试剂

以张力环炔烃这种亲偶极子试剂为例，说明对生物正交环加成的调控。为了提高反应速率或提高环的稳定性，已经进行了大量的努力来修饰张力环。例子包括调节环的大小或构象，电子扰动，内环杂原子的安装及其组合（图四b）。还为增加这些脂肪族探针的水溶性做出了巨大努力。已经研究了杂环衍生物（最多12元环）杂原子变体通常更水溶性和稳定。但是，扩环的好处是以牺牲速率为代价的：这是生物正交试剂调整中普遍存在的折衷方案。考虑到兼顾反应性和稳定性，BCN是一种更具影响力的环炔烃。与环辛炔相比，该骨架具有更大的张力（由于稠合的环丙烷环），但在细胞环境中非常稳定。加上其合成的可得性，BCN已成为几个领域中用于环加成反应的主要张力炔烃。在最近的例子中，BCN-荧光团缀合物用于活细胞的超分辨率成像（图四c、d）。 FtsZ是一种参与细菌细胞分裂的蛋白质，通过酶化学处理装上叠氮化物。随后用细胞可渗透的BCN衍生物（带有光开关的若丹明）进行处理，可以观察到蛋白质的定位模式。

图4丨用于偶极环加成反应的一系列试剂。a丨各种1,3-偶极子可用于生物正交标记。有机叠氮化物是最早被用于细胞中环加成反应的物质。最近，已经开发出重氮，亚砜和硝酮官能团用于生物分子标记。高反应性偶极（包括一氧化二氮，亚胺和乙叉化物）也是可行的连接子，通常通过光解或化学解笼作用“按需”生产。b丨可用于生物正交环加成的几种类型张力炔。这些试剂来来源于环辛炔的变体。对环辛炔的广泛修饰提供了具有可控反应性的试剂组合。c丨在生物正交环加成中的示例应用。FtsZ。一种参与细胞分裂的细菌蛋白配有叠氮化物提手。随后与双环[6.1.0]壬炔（BCN）-可光转换的荧光团结合物的连接使得在活大肠杆菌中能够进行超高分辨率显微镜检查。d | FtsZ在活大肠杆菌中定位的衍射极限荧光（左）和超分辨率（右）显微镜图像。插图显示细菌细胞的明场图像。

通过使用计算化学方法，科学家更易于调控环炔的反应性。计算化学可以同时预测空间结构和电子特征，调控骨架以获得所需的结果。一种完整的调节环加成反应对的方法依赖于畸变/相互作用模型。该分析通过计算形变能（即反应物通过理想的过渡态几何结构所需的能量）和相互作用能（与两个反应物分子之间的轨道重叠有关）之间的差来计算给定反应的激活势垒。然后将计算出的活化能与预测的速率常数相关联，该常数最终可以指导调控试剂。畸变/相互作用模型在生物正交试剂设计中的最早应用之一涉及一系列的双芳基环辛炔酮类似物。这项研究揭示了阻碍双芳基环辛炔酮与叠氮化物反应的结构特征，并为开发改进的环辛炔奠定了基础。除其他生物正交环加成反应外，类似的计算研究已用于微调悉尼酮-环炔反应。

调整亲二烯体的生物正交环加成反应

近年来，IEDDA反应领域的并行发展进一步扩大了生物正交化学的数量。特别是具有TCO的反应已在细胞和体内中广泛使用。这样的转化也已经成为广泛的试剂调控的目标。大量的努力集中在加速四嗪TCO连接的动力学上（图五）。假设增加TCO张力可提高反应速率，类似于偶极环加成中炔烃的应力作用。为此，Fox及其同事设计了一种骨架，其中TCO被迫采用半椅构型（包括带有二氧戊环的TCO（d-TCO）和张力的TCO，称为s-TCO）。预计这些官能团的能量比TCO的冠状构象高5.6-5.9kcal mol-1。反应性更强的d-TCO和s-TCO变体显示的双分子速率常数高达3x 106M-1s-1。

与张力炔烃相似，对张力烯烃也采用了环收缩策略。例如，反式环庚烯（TCH）类似物是IEDDA与四嗪类环加成反应中的强亲二烯体。TCH在环境条件下易于异构化，但可以与一价银形成稳定的复合物并被分离出来。另外，结合内环硅原子可以制备产生更稳定的七元环烯烃sila-TCH（SiTCH）。SiTCH中较长的Si-C键长度可减轻某些环张力，从而较容易实现分离。计算化学研究表明，SiTCH与二苯基四嗪的反应活化障碍明显低于s-TCO，从而可以快速连接。SiTCH和模型四嗪的二级速率常数为1.14x 107M-1s-1，是有记录以来最快的生物正交连接。然而，尽管它们的速率很高，但是在存在细胞硫醇的情况下，TCH和SiTCH会迅速降解。

图5丨用于IEDDA反应的张力烯烃的示例。亲二烯体已被广泛地调控以调节反电子需求的Diels-Alder（IEDDA）与四嗪的环加成反应的速率。反式环辛烯（TCO）是典型的亲双烯体。对TCO进行了修释以获取反应速度更快，更具生物相容性的试剂。一些骨架具有内环杂原子（DOTCO，OSi-TCH和oxoTCO），构象约束（二氧杂TCO（d-TCO）和张力TCO（s-TCO））和收缩环（反式环庚烯（TCH）和sila-TCH （SiTCH））。通常，在存在生物硫醇的情况下，最快的反应骨架表现出最短的半衰期（t1/2）。PBS为磷酸盐缓冲溶液。

1,3-二取代的环丙烯，作为IEDDA反应的替代性亲二烯体，也已针对各种应用进行了调控。Nguyen和其他人报道这些骨架可在生物环境中与四嗪反应。与TCO相比，四嗪和环丙烯之间的反应要慢得多，但是，环丙烯的小尺寸和细胞稳定性使其在复杂环境中对生物分子的研究具有吸引力。Chin及其同事的一个著名例子使用了环丙烯赖氨酸类似物来监测果蝇中新生的蛋白质生物合成。

改变环丙烯的空间结构会显著反应性。使用畸变/相互作用模型可以预测，环丙烯C3位的空间体积增加会大大降低其与四嗪的反应性。反应性降低归因于过渡态的几何约束。预测环加成反应物种之间的轨道重叠阻碍会减慢连接速度。的确，即使3,3-二取代的环丙烯经受各种官能化的四嗪，也没有实验观察到反应，但是3,3-取代的环丙烯仍然与腈亚胺反应，这种差异反应性被用来串联标记两种蛋白质。

通过在C3引入螺环可以进一步调控环丙烯。根据晶体学数据，与母体环丙烯1相比，环丙烯2在两个C3基团之间的键角减小（图六a）。减小的键角使取代基远离引入的腈亚胺，并使反应速率增加15倍（图六b）。螺环环丙烯还显示出与某些四嗪的反应性，并已被用于标记活细胞中的细胞表面受体。螺环内的杂原子通过降低LUMO能量进一步提高了环丙烯的反应性。最新的研究中为螺环环丙烯装配了光敏笼。打开开关后骨架可用于IEDDA连接。这些被锁住的试剂同时对生物分子进行时间-空间上的标记，但其合成仍然具有挑战性。

还已经研究了四嗪作为其他生物相容性环加成反应的反应物，例如涉及异腈的转化。这些亲二烯体通过[4 + 1]环加成与四嗪反应生成亚胺产物。对于伯、仲异腈，所得的亚胺容易进行互变异构化和水解，从而释放出胺。事实证明，此类异腈可用作氨基荧光团和小分子药物的笼子。适当调控的异腈可以减轻水解，例如，叔异腈与四嗪反应形成稳定的连接加合物，因为它们无法进一步反应。由于其体积小，用途广泛，因此已被用于标记生物分子，包括蛋白质和多糖。

简单的乙烯基也与四嗪探针进行IEDDA反应。乙烯基基序的小尺寸对于生物分子标记策略具有吸引力。然而，即使使用富含电子的乙烯基试剂，迄今为止所检查的大多数烯烃都具有较低的水溶性和较慢的反应速率。相比之下，乙烯基硼酸（VBA）与四嗪的反应明显更快。反应释放出硼酸，这是该反应的主要驱动力。配备富电子的VBA和配有羟基的四嗪（与硼酸基序配位）可实现更快的环加成反应，VBA-四嗪连接已被用于剖析蛋白酶体抑制剂在活细胞中的功效。已对许多其他环状烯烃和丙烯酸烯烃进行了与四嗪反应的研究。

图6 | 立体修饰可调节环丙烯的反应性。a丨与母体化合物1相比，螺环环丙烯2中C3取代基之间的夹角减小。b丨减小的键角将过渡态的空间碰撞减至最小，从而加快了与腈亚胺的反应。krel为相对速率常数。

调控二烯体的生物正交环加成反应

IEDDA反应的另半部分，即二烯（通常为四嗪）也已被修饰以改变稳定性和反应性（图二Bf）。在一实施例中，通过电子摄动来调节四嗪探针的稳定性。最初发现含有四嗪官能团的氨基酸在细胞环境中水解， 不稳定的仲胺键促进了水解，给电子胺基团也减慢了IEDDA反应速度。去除”胺把手”解决了这两个限制。在另一个实例中，合成了平面四嗪以促进胺的快速释放与TCO反应。用带有TCO笼的氨基酸的模型酶筛选四嗪，最好的四嗪类化合物在少至50 μM的浓度下，可在4分钟内完成几乎定量的反应。

在生物正交化学中，某些四嗪反应所达到的速率是无与伦比的。然而，如此高的速率通常以探针稳定性为代价。许多最具反应性的四嗪与硫醇反应，可导致脱靶效应和细胞中高背景标记物。为了解决这一问题，一些研究小组从笼状生物正交试剂中汲取了灵感，这些工作集中于利用官能团的氧化还原特性原位释放活性四嗪。还原性二氢四嗪对亲二烯体无反应，在生物环境中稳定。然后可以使用酶法或光催化法将二氢四嗪原位氧化为四嗪。这样的策略甚至可以将最具反应性的四嗪应用于生物环境中。锁在笼中的四嗪也已被用于用生物分子修饰电极表面。

一些四嗪官能团的不稳定性激发了对缺电子性较弱的二烯的探索，包括1,2,4-三嗪。像它们的四嗪类似物一样，三嗪通过IEDDA与张力的π系统（例如TCO和BCN）反应。尽管这些反应的速度明显慢于四嗪，但三嗪可以在存在生物硫醇的条件下在升高的pH值下稳定超过24小时。此后，这些骨架被安装在蛋白质中，并在体外酶促地附着在DNA上。1,2,4-三嗪还经过电子调谐，以实现更快的动力学活性。例如，吸电子吡啶鎓基团已被用于增加环加成速率。这些骨架已被用于标记活细胞中的线粒体。对三嗪核的微小空间修饰也改变了与张力炔烃的反应方式。在最近的研究中，畸变/相互作用模型预测C3和C6处的三嗪取代将减少与空间位阻大的张力炔烃的反应性。为了使成键中心（也就是C3和C6）的空间碰撞减至最小，预测此类反应仍可使用C5取代的异构体进行。通过同时、双重标记两个蛋白质靶标的实验证实了这些预测。

可以参与IEDDA环加成反应的二烯的数量也在增加。最近显示，含氮杂环4H-吡唑可与张力的BCN反应。首先，吡唑需要调控以提高反应速率， 通过添加氟取代基通过逆向的超共轭作用增加了骨架的抗芳香族特性。吡唑环的这种失稳将因此导致更快的连接。计算分析证实，偕二氟基团会降低4H-吡唑的LUMO能量，从而导致与BCN的快速反应性。沿着反应坐标的这种抗芳香性考虑可以在生物正交反应设计中更普遍地利用。

另一类二烯包括邻醌，张力促进的氧化控制的环辛炔与1,2-邻醌环加成反应是一个例子。在早期迭代中，使用外源氧化剂将1,2-邻苯二酚转化为相应的醌。这些张力促进的氧化控制的环辛炔-1,2邻醌反应比叠氮化物-炔烃环加成反应（二阶速率常数约为500 M-1s-1）快几个数量级，并且与某些四嗪-TCO连接反应相当。后来的研究表明，可使用酪氨酸酶将可遗传编码的酪氨酸标签原位选择性氧化为醌。然后可以将这些官能团用于附加小分子以形成抗体-药物偶联体（ADC）。该策略使得能够控制附着于抗体的“弹头”的位置和数量。邻-喹诺酮也能与诸如环丙烯之类的张力烯烃有效地反应。但是，原位生成邻醌的要求可能会带来一些限制。已经研究了邻-喹啉酮醌甲基化物作为更通用的替代物，因为这些骨架可以在生物环境中原位产生而无需外部触发。这些官能团通过杂Diels-Alder环加成反应与乙烯基硫醚强烈反应，形成不寻常的硫缩醛加合物，并在各种pH值下在水溶液中均稳定。

结合相互正交的反应

从上面可以明显看出，过去十年来，可用于生物应用的化学反应数量激增。尽管工具包已扩展，但一次应用多个反应仍然具有挑战性。新反应的开发主要集中在标记单个目标上。鉴定生物正交化学的相容组合将使多组分标记研究成为可能，从而拓宽了可以检查的生物过程的范围。从历史上看，找到这样的反应组合一直是一项挑战，因为许多常见的试剂会相互交叉反应。近年来，借助计算化学和反应调节，人们对正交反应的搜索已大大加快。

具有独特机理的生物正交反应非常适合于多组分标记研究。具有不同反应模式的试剂通常可以缓解交叉反应问题。例如，叠氮化物-炔烃环加成可与肼-酮缩合、各种IEDDA试剂、一些1.3偶极子和其他官能团串联使用。还研究了使用三个相互兼容的生物正交基团的策略，以三标记法为例，该方法以含叠氮化物，含环丙烯和炔烃的糖为特征，研究植物细胞中糖代谢的异质性。但是，由于反应物种之间的交叉反应性，无法同时进行连接。连接之间还需要进行笨拙的洗涤，从而破坏了时间尺度上的分辨率。迄今为止，只有三项研究同时进行了三重标记。一个例子是使用两种四嗪：一种在空间上受阻并与少量异腈选择性反应，另一种在典型的IEDDA环加成反应中将TCO连接起来。将四嗪反应与叠氮化物-张力的炔烃对合并以进行三重标记。混合三种模型蛋白，分别用大体积的四嗪，空间位阻较小的四嗪或叠氮化物标记，并与与异腈，TCO或张力炔偶联的光谱分辨荧光团反应。通过凝胶内荧光检测匹配的加合物，没有交叉反应的迹象（图七）。尽管这项研究仅在模型环境中展示了三组分标签，但该试剂应也适用于其他生物学环境。

图7丨结合生物正交化学进行多组分标记。a |有三个不同的反应：[4 + 1]四嗪（Tz1）-异腈环加成，[4 + 2]四嗪（Tz2）-反式环辛烯（TCO）环加成和[3 +2]叠氮化物-二苯并环辛炔（DBCO）环加成 用于同时标记三种模型蛋白（牛血清白蛋白（BSA），卵清蛋白（OVA）和溶菌酶（LYSO））。b |通过凝胶电泳，然后进行荧光扫描，观察共价蛋白加合物。没有检测到交叉反应。

探索新的反应类型

以识别为目的其他类型的生物正交化学将继续支撑多组分标记研究。最近探索化学空间新领域的努力和对现有连接的其他调整是富有成果的， 硼试剂在这方面已受到关注。在一实例中，二硼探针与N-氧化物选择性反应。重要的是，连接是在最严苛的生物环境之一的细胞内有效进行的。该反应的独特机理也与几种现有的生物正交化学相容。

极性试剂设计中最值得注意的发展也许涉及到六价硫氟化物。这些官能团在细胞环境中非常稳定，并通过六价硫氟化物交换（SuFEx）化学与氧或氮亲核试剂发生强烈反应。SuFEx试剂已用于基于药物设计、活性蛋白和其他蛋白质靶向研究。它们也已用于通过邻近驱动的交联来检查蛋白质-蛋白质相互作用。SuFEx亲电试剂还提供了一种温和方便的方法，可将生物正交叠氮化物引入各种胺靶标，进一步例证了这些官能团的用途。

对新的环加成平台的探索也正在扩展生物正交工具包。一个例子涉及四环庚烷额连接。 该反应是与镍-双（二硫代戊二烯）配合物的 [2σ+2σ+2π]环加成反应，这是一种独特的反应方式。四环庚烷是高度张力的分子（张力能约为80 kcal mol-1），但可以在水溶液条件和存在硫醇的环境中稳定较长时间。四环庚烷甚至已通过遗传密码扩展用于细胞内标记应用。四环庚烷反应的新颖性可能会激发继续探索其他用于生物正交应用的环加成组合。

生物正交反应也已经扩展到包括过渡金属。这些金属实际上在细胞环境中不存在，并且可以形成稳定的C-C键，从而使其对选择性标记应用具有可行性。关于此主题的重点评论可以在其他地方找到，但我们在下面重点介绍一些著名的例子。水溶性一价金络合物已被开发来驱动在水性介质中形成共价键。金纳米颗粒也已用于斑马鱼的成像。尽管金属络合物必须与骨架蛋白结合，但是可以利用更多反应性的二价金物种进行选择性酰胺化反应。受铜催化的启发，几个研究小组对配体进行了优化，以形成水溶性，毒性最小的钯配合物。一些已被用于细胞中的Suzuki-Miyaura偶联，以及Sonogashira反应和炔基-氨基甲酸酯脱保护。钯纳米颗粒和其组件也已经被开发用于在纤维素中进行各种转化。钌化学和铱光催化学方面的类似进展使生物分子靶向成为可能。

蛋白质生物共轭技术的新发展也被用于更普遍的生物正交应用。例如，芳基重氮离子是与富电子芳族侧链（例如酪氨酸）强烈反应的亲电子试剂。由于蛋白质中酪氨酸残基的丰度，使用芳基重氮进行特定位点修饰在历史上具有挑战性。进一步的研究揭示了5-羟基色氨酸与芳基重氮试剂之间的选择性反应。5-羟色氨酸中额外的电子密度使得能够使用反应性较低的重氮试剂，从而防止了其他芳香族侧链（例如酪氨酸）的背景标记。此反应此后已用于标记重组蛋白和抗体衍生物，并且预期会有其他靶标。其他蛋白质标记策略的进一步调控可能会提供更多的生物正交试剂。

总结

生物正交化学的核心是在严苛环境下控制反应性官能团。如何设计一对试剂以在细胞或整个生物体内形成单一加合物？对这些反应的严格要求经常迫使研究人员探索非常规的方法。历史性的工作提供了一套初始试剂，其中许多试剂仍用于体内生物分子的检查。

近年来，通过迭代调整已建立的探针，使得工具箱已大大扩展。这些研究中出现了一些“共同的主题”。例如，可以根据物理有机化学的通用原理对第一代工具的速率和稳定性进行调节，以适应特定的应用。某些修饰的效果通常可以通过计算来预测。在寻找相互兼容的反应组合时，计算分析也可能是非常重要的。

经过数十年的生物正交化学尝试，仍然没有一种普遍适用的反应。而是存在多种反应性，而挑战在于知道如何最好地应用探针。在调节高反应性化学官能团方面的最新成功表明，可以利用其他边缘官能团来认识生物学。不仅需要单组分反应，而且还需要可串联使用的生物正交化学的组合。在这方面，继续探索独特的反应方式将是有用的。本综述中重点介绍的策略和示例为继续扩展生物正交工具包提供了路线图，将化学研究从烧瓶中转移到生物系统中。

原文链接：doi:https://doi.org/10.1038/s41570-020-0205-0