【ACS Catal.】GH3家族N-乙酰氨基葡萄糖苷水解酶磷酸化酶的进化

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on style="white-space: normal; text-indent: 2em;">糖苷磷酸化酶在合成有价值的糖类、糖苷类和聚糖或开发高效节能微生物细胞工厂方面具有巨大的潜力。然而，可用的特异性磷酸化酶的数量相当有限。近期，比利时根特大学Tom Desmet组，在绿脓杆菌和枯草杆菌的GH3糖苷水解酶中建立显著的磷酸化酶活性。

图片来源：ACS Catal.

 
首先，通过构建序列标志来指导寻找在水解酶中高度保守但在假定的磷酸化酶中被不同氨基酸占据的位置，反之亦然。然后利用铜绿假单胞菌的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的晶体结构考察了这些位置的结构环境，其整个催化循环已在前期的工作中阐明。研究发现，活性部位的三个位置33位、62位和70位有潜在改造价值。


图片来源：ACS Catal.

 

将水解酶保守位点33位、62位和70位替换成磷酸化酶对应的氨基酸残基，获得三突变体F33R/D62N/R70A，核磁检测有新产物，表明该突变体有磷酸化酶活性。


图片来源：ACS Catal.

 

通过组合饱和突变，这种混杂的功能可以进行进一步的优化。


图片来源：ACS Catal.

 

总之，这些发现表明，未来可以从水解酶作为工程化模板开始发展磷酸化酶。此外，该研究还对天然GH3磷酸化酶中难以理解的磷酸化酶活性决定因素提供了进一步的见解。



参考文献：Evolution of Phosphorylases from N‑Acetylglucosaminide Hydrolases in Family GH3

ACS Catal. 2021, 11, 6225−6233

原文作者：Jorick Franceus, Jolien Lormans, Lore Cools,Matthias D’hooghe, and Tom Desmet*


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