成果简介

加州大学圣地亚哥分校的Michael D. Burkart教授和Neal K. Devaraj教授近日在J. Am. Chem. Soc.上共同发表了一篇题为“Chemoenzymatic Generation of Phospholipid Membranes Mediated by Type I Fatty Acid Synthase”的研究论文。在这项工作中，作者采用细菌I型FAS（cgFAS I）结合天然化学连接（NCL），从简单的水溶性脂肪酸前体自发生成膜形成合成磷脂（图1）。这一种化学酶法可以从头开始形成膜，即在无预先存在的膜的情况下形成膜。化学酶促磷脂的形成可提供更简单的策略，以在合成细胞中产生膜区室，支持重组膜蛋白的方法的发展，并促进天然和非规范脂质的合成。

图文解读

图1 FAS介导的化学酶促磷脂合成的示意图。细菌I型FAS使用乙酰基-CoA，丙二酰-CoA和NADPH原位合成棕榈酰-CoA 1。随后通过天然化学连接（NCL）与半胱氨酸修饰的溶血磷脂2反应形成磷脂3，其自发地自组装成膜结合的囊泡。

图2 由细菌I型FAS（cgFAS）介导的棕榈酰-CoA 1的原位合成。作者首先为原位形成活化脂肪酸确定了合适的FAS。II 型FAS由多种酶协同作用组成，而I型FAS由具有催化结构域的单个多酶复合物组成，它们相互协作以形成脂肪酸。I型FAS将乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A以化学计量形式产生中链脂肪酸（图2A）。图2A为迭代脂肪酸延伸周期的示意图。丙二酰基-棕榈酰基转移酶（MPT）将最终的棕榈酰基部分转移至CoA分子以形成1[AT：酰基转移酶；ACP：酰基载体蛋白；KS：酮合酶；KR：酮还原酶；DH：脱水酶；ER：烯酰还原酶]。N端His 6标记的I型cgFAS在大肠杆菌中表达，并通过采用先前报道的程序进行纯化。使用快速蛋白质液相色谱（FPLC）色谱柱上的尺寸排阻色谱（SEC）验证了蛋白质的完整性及其寡聚状态（图2B）。然后对这些馏分进行烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）消耗测定，以验证cgFAS活性（图2C）。与以前的报告一致，观察到棕榈酰辅酶A 1是cgFAS催化反应的主要产物。脂肪酸甲酯（FAME）形成后，使用气相色谱质谱（GC-MS）联用技术（图2D），观察到1占形成的总脂肪酸种类的93％。

图3 为了确定非经典磷脂3形成膜结合囊泡的能力，进行了显微镜研究。棕榈酰辅酶A 1和溶血磷脂2均未在水溶液中形成膜。水合时，磷脂3易于形成膜结合的组件（图3）。最初通过相差（图3A）和荧光显微镜使用膜染色染料BODIPY-FL DHPE（图3B）鉴定脂质囊泡。在磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，37°C下将3 水化和搅拌1 h后，观察到直径为1-10 μm的囊泡。透射电子显微镜（TEM）也证实了囊泡结构的形成（图3C）。通过在高极性荧光染料8-羟基-1,3,6-三磺酸（HPTS）存在下3的脂质薄膜水合来证明磷脂囊泡的包封能力，然后通过使用荧光显微镜对囊泡进行表征（图3D）。

图4 表征了各个酶和化学反应的特征后，作者接下来探索了在一锅法反应中将酶促棕榈酰-CoA 1合成与化学磷脂3合成相结合的过程（图4）。简而言之，作者将溶血磷脂2（400 μM）添加到pH 7.4的10 mM磷酸盐（Na₂HPO₄ / NaH₂PO₄）缓冲液中，其中含有cgFAS I（1 μM），乙酰-CoA（1 mM），丙二酰-CoA（1 mM），NADPH（10 mM）和=与TCEP（10 mM）。使用HPLC-MS-ELSD测量来跟踪磷脂的形成。反应条件的优化使通过cgFAS I生成的1和2能够快速偶联。一锅反应在30分钟内提供了相应的磷脂3作为主要产物（图4A）。所有溶血磷脂2在不到4小时内被消耗（图4B），得到367 μM磷脂3。反应30分钟后，使用BODIPY-FL DHPE通过荧光显微镜检测了小的囊泡结构。使反应在37°C搅拌过夜后，我们观察到直径在1-2μm的较大囊泡（图4C）。通过BODIPY-FL DHPE的荧光显微镜观察，在37°C下，囊泡在48小时内是稳定的(图4D)。

总结与展望

本工作中，作者开发出一种化学酶法从水溶性前体合成非经典磷脂。 这一方法可以灵活地使反应中产生的脂质种类多样化。文中利用cgFAS I选择性地生成棕榈酰辅酶A，如果使用其他生物脂肪酸合酶也可以形成多种多样的脂肪酰基辅酶A，随后可以将其与反应性溶血磷脂偶联以产生多种种非经典脂质。例如，已知许多细菌中的FAS可以从支链的短链羧酸前体（如甲基丙二酰-CoA）合成末端支链的异构、反异构或ω-脂环族脂肪酸。作者希望利用各种磷脂物种的原位合成，以促进对脂质膜组成如何影响囊泡组装、生长和分裂的研究。

作者简介

Michael D. Burkart 教授

文献链接

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c02121?ref=pdf