第一作者：麻光磊
通讯作者：梁照珣教授
通讯单位：新加坡南洋理工大学
论文DOI：https://doi.org/10.1021/jacs.1c10369
on style="text-indent: 0em; white-space: normal; line-height: 1.75em; box-sizing: border-box; margin-left: 8px; margin-right: 8px;">本研究报道了一类微生物来源的结构新颖的含腙类环肽成分，并从生物合成角度解析了该类天然腙基的合成机制，即为基于体内重氮化和Japp-Klingemann偶联反应的新机制。腙基（-N-N=C-）因其高效易得的反应特性常作为模块化的连接基团或先导结构应用到药物递送、光敏试剂及新环系构筑等系统当中。尽管腙基类化合物已被药物/有机化学家和材料科学家广泛合成，但天然来源的含腙基化合物鲜有报道，对它们的生物合成机制更是知之甚少。近年来，虽屡有催化N-N键形成的新酶系报道，但其产物均为合成通路的终产物且结构多为烷基肼类而非芳香类。而本研究首次详实地报道一类可催化N-N键形成重氮化芳香产物的新型酶Aha11，该高反应活性的重氮化产物可进一步与醛基类环肽前体发生体内的Japp-Klingemann偶联反应形成腙基结构，展示出了生物体内重氮化修饰所具有的重要衍生化优势和潜力，为芳香类化合物的合成生物学研究提供了更多的思路。本部分，因研究内容的行文思路和详细的结果展示已在英文原文中或相关的文章推送中一一陈述，在这里不再累述。此处，笔者将从实验员的角度出发，主要针对工作在第一线的年轻的研究生学者们，对于实验方案实施过程中遇到的棘手问题，以问题挑战和应对策略的形式，对该项研究进行扼要的内容梳理并附带部分感想和体会，希望对正处于课题研究当中的研究生们有所裨益。本研究内容历时多年，由课题组成员通力合作完成，因此内容较为充实和完整，比较系统地解析和阐述了一类腙基天然成分的生物合成机制。而整个课题的实验设计和研究进度是逐步推进、循序渐进的。研究的内容也是从点及线、再到面逐步去延伸的，从新结构的发现和结构解析、生物合成基因簇的确定到关键酶的锁定、体外活性表征，从关键多肽前体的追踪、鉴定到最终体外构筑整个分子骨架，个中虽遇到了多种困难挑战所幸最终都一一化解，并从中获益匪浅。4.1 天然腙基类环肽成分Tasikamides的发现和鉴定新颖天然产物的快速发现始终是天然产物领域的一个难点。近年来基因信息学的发展为新颖结构的发现提供了新的思路和方法，但多数生物合成基因簇（BGC）的沉默现象却成为了一个新的难点。因此，在实际的实验过程中仍需结合传统方法（化学筛查、活性导向），联合运用多种手段去高效地发现新颖成分。本课题主要采用的是代谢产物的化学导向分析方法从链霉菌P46中发现了该类新颖的tasikamides。在结构鉴定上，腙基官能团中N-N键由于存在两个连续的氮原子，依靠传统的1H和13C NMR测试是较难确定其结构的，因此，本文采用了15N同位素标记方法先获得15N标记的tasikamides，而后通过1H-15N HSQC/HMBC等氮谱NMR测试确定了腙基的结构。目前，同位素标记法已广泛地应用到天然产物的鉴定及生物合成研究当中，且通过对比分析同位素标记前后代谢产物的质谱差异来寻找特定化合物常会收获事半功倍的效果。4.2 参与合成tasikamide A (1)的两条基因簇的确定Tasikamides结构中包含环肽母核（TSK）主片段和亲脂性邻氨基苯甲酯(AHA)侧链，且两者之间通过腙基进行连接。负责合成环肽母核TSK部分的NRPS生物合成基因簇可通过antiSMASH的预测分析结合环肽的五肽缩合、甲基化、羟基化等结构特征合理推测其应为BGC22,当然确凿的证据需要通过基因敲除和产物分析来佐证。此处的难点为如何确定另一片段AHA的合成基因簇，由于在tsk BGC中，或其临近的基因区域内，亦或是剩余的所有antiSMASH标注的BGC中都无法找到能与AHA结构相对应的合成基因，我们猜想可能是由于负责合成AHA的基因片段过小、呈散状分布或从未表征过而无法被antiSMASH识别，因为我们首先推测了合成AHA片段可能所需的关键基团，而后在整个基因组中对其进行了检索，从而确定了可能的aha BGC，进一步的确认我们是通过体外重构了AHA的生物合成途径，该部分工作包含了大量的蛋白纯化及体外生化反应，对我们在蛋白纯化技术及生化条件优化的技能掌握上是一个很好的训练，为后续处理技术难度较高的问题打下了基础。首先是要初步锁定参与N-N形成的候选酶范围。该部分的分析预测需要借用到大量的生物信息学分析工具和相关的文献查阅，最终我们将目标聚焦到了aha BGC中额外的三个基因Aha1,Aha2和Aha11。Aha1和Aha2根据序列同源性分析推测它们的功能应是催化谷氨酸形成亚硝酸（NO2-），为快速的验证该推论我们进行15N标记的NO2-饲喂实验，并通过MS和核磁数据分析证实腙基中的中心氮原子来源NO2-,同时也间接表明Aha1/2参与到了腙基的生物合成途径中。紧接着便是Aha11的功能确定，由于其极低的同源性特征Blast分析中并没有得到有用的信息，我们转而进行了体内基因敲除实验希望从中寻找突破。可喜的是，敲除aha11的菌株不再产生含腙基1-3，而继续产生环肽AHA母核4-7及AHA侧链8-10，表明aha11对腙基中N-N键的形成至关重要，此时可武断认为aha11具有直接催化N-N键形成的作用。当然，此推断需要经体外Aha11催化实验去证实，同时基于前述分析我们合理推测参与该N-N键形成的含氮底物应分别为AHA和NO2-。已确定好参与形成的N-N键所需的酶及底物，接下来就是尝试和优化各种生化反应条件在体外构建出该步反应。此处需要大量的阅读文献收集相关的反应条件以及与导师及时进行探讨交流汲取经验。经过大量的条件摸索，我们发现在ATP、Mg2+、NO2-存在的碱性环境下（pH=8），Aha11可催化AHA（8）与NO2-发生重氮化反应形成重氮化产物diazo-AHA (11)。该过程体会较深的是，当从体外实验（如关键酶锁定、条件优化）无从下手时，可先尝试从体内实验（如基因敲除）入手寻找线索，缩小或锁定目标功能酶；当从生物角度无法进行预测难以推动时，可从化学角度尝试突破，该体会在下节的多肽前体发现过程中尤为明显。已经表征Aha11的生物功能及相应的重氮化产物11，从化学结构角度看重氮类化合物11具有非常活泼的反应活性，因此我们推测在环肽结构4-7或其他未知的衍生物中是否会存在一个前体的环肽结构可与11发生反应形成腙基以及化合物1-3。带着该设想，我们首先尝试在体外将重氮化产物11与化合物4-7或混合物馏分（30-40 min）进行反应，但均未检测到化合物1-3的产生，原因可能是环肽混合物中并不存在这样一个前体结构或者存在该前体但需要合适的反应条件才可发生。对于第一个疑问--是否存在这样一个环肽前体，我们设计了针对TSK代谢功能丧失的∆tskJ的饲喂实验，结果显示培养基中加入化合物4-7均不能使∆tskJ恢复产生1-3，而当加入混合物（30-40 min馏分）则可以恢复1-3的产生，表明在混合物中存在一个可参与合成腙基片段的未知前体。为追踪该前体结构，我们进行了多轮次的液相纯化和饲喂实验并成功导向分离到该前体结构，根据质谱信息及易降解特征推测其结构可能为含有醛基片段的环肽类成分；为进一步验证其结构，我们采用了醛基的专属颜色鉴定反应（Schiff test）以及衍生化处理（Brady reagent）方案结合NMR数据确定了其结构为i-butyl片段为β-keto-醛基的环肽类衍生物14。4.5 Japp-Klingemann偶联反应完成腙基N=C的形成及tasikamideA的骨架构建由形成tasikamideA所需的两个片段（重氮化的11和含醛基环肽结构14）可联想到两者可能是通过Japp-Klingemann偶联反应形成腙基；同时，从反应机理上考虑，亲核性14应在到碱性活性下具有较高的反应活性，可与亲电性11发生偶联、脱羧、重排等反应形成腙基以及tasikamide A (1)。在此指导下，我们在pH=8的弱碱条件下成功证实重氮化产物11和14可经体外的非酶自发反应形成腙基，即形成化合物1。自此，我们完成了tasikamide A (1)的生物合成途径详细的解析过程，并经体外酶催化、非酶自发反应重构了腙基的形成过程。值得一提的是，通过Japp-Klingemann反应合成腙基结构在化学合成中较为常用，而意外的是自然界中的生物体竟采用同样的合成途径代谢腙基类成分。我们从链霉菌中发现了一类含有腙基的新颖环肽类结构，研究表明该类结构是由两条生物合成途经的产物发生偶联形成。结构中腙基的形成经历了两个步骤，Aha11催化的N-N的形成以及Japp-Klingemann偶联完成N=C键的构建。这是Japp-Klingemann偶联反应首次被报道在生物体内发生。Aha11所催化N-N键形成产物为高活性的芳香重氮化产物，该类结构在合成化学中常作为重要的中间体参与构筑多种芳香类骨架，因此Aha11可作为体内构建重氮化结构的工具酶应用到多种芳香类衍生物的合成生物学研究当中。本文第一作者为南洋理工大学博士后麻光磊，麻光磊博士2018年毕业于复旦大学药学院药物化学专业，博士阶段的研究方向为药用植物来源的新颖成分的发现、修饰及活性评价，后加入梁教授课题组开展微生物来源的复杂天然产物的生物合成研究，目前已发现和解析了多个新颖结构的生物合成机制。新加坡南洋理工大学生命科学院梁照珣教授课题组长期致力于: (1）细菌致病和抗生素耐药性的分子机制研究；（2）微生物酶的发现及合成生物学研究。欢迎有志于生物化学与分子生物学，微生物遗传学及天然产物化学的同学加盟。https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c10369
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