分享一篇近期发表在Journal of the American Chemical Society上的文章，题为：Topologically Engineered Supramolecular Cyclolipid Nanoparticles: A Custom-Tailored Delivery System for Inhaled Combination Therapy。该文章的通讯作者为来自清华大学的喻国灿副教授。

    肺部疾病每年会在全球范围内导致近400万人死亡，属于常见且重要的疾病，而基于siRNA的RNA干扰疗法（RNAi）为此类疾病的治疗提供了一个有前景的策略。siRNA作为一种带负电的亲水生物大分子，容易在体内被清除，难以直接穿透细胞膜，且肺部疾病可以采用的吸入给药虽然具有靶向优势，却也对siRNA递送系统提出了更高的要求：需要在肺部环境中保持稳定，并实现有效的粘液渗透和内体逃逸。为了克服这些障碍，一系列脂质纳米颗粒（LNPs）递送系统被开发，但内体逃逸效率都不理想。因此，亟需开发出能同时实现高效的内体逃逸和卓越的循环稳定性的新型递送系统。

    本文中，作者设计并合成了一种基于β-环糊精（β-CD）的可电离环脂，通过静电、疏水、主-客体相互作用形成CNPs@siHsp47/PFD共递送靶向热休克蛋白4的siHsp47和抗纤维化药物吡非尼酮（PFD），并添加10%的PEG-Lipid稳定纳米颗粒。该环脂具有复杂的锥形拓扑结构，可以诱导内体膜从层状相向六角相转变，从而破坏膜稳定性，提高内体逃逸效率，并具有出色的生理稳定性。如图1所示。

图1. CNPs@siHsp47/PFD的组分示意图

    作者首先根据β-CD伯羟基和仲羟基反应活性的不同进行选择性修饰，得到一侧有7个叔胺和7个仲胺，一侧有14个疏水烷基链的可电离环脂，可电离基团与烷基链的比例与商用可电离脂质SM-102相似。但是由环脂制备的CNPs由于聚集无法在生理环境中保持稳定，因此作者又将PEG-Lipid共组装进入 CNPs，发现10% PEG-Lipid掺入得到的CNPs表现出最好的稳定性，且siRNA递送效率也高于未掺入组和5%掺入组，因此选择含有10%PEG-Lipid的CNPs进行后续研究。与LNPs相比，CNPs的临界胶束浓度更低，在血清中稳定性更高，证明了CNPs的体内应用潜力。如图2所示。

图2. 可电离环脂的合成及稳定性测试

    为了验证CNPs在内体逃逸中的优势，作者通过多尺度分子动力学模拟与实验分析系统探究了其作用机制。分子动力学模拟显示，基于β-CD的锥形环脂在相同条件下的渗透速率显著高于SM-102，这是因为体积庞大并具有高亲脂性的环脂在穿透磷脂双分子层时会引发膜局部显著形变，膜分子被迫重排或迁移，导致结构完整性被破坏，最终因应力集中超出膜弹性极限而破裂。相比之下， SM-102仅引起轻微形变，膜结构保持完整。利用FRET实验定量研究内体模拟脂质体的膜破裂程度，CNPs组远超LNPs组，与理论计算结果相符。如图3所示。

图3. 锥形拓扑结构促进内体逃逸

    PFD是FDA批准的抗纤维化药物，可以通过下调转化生长因子β1（TGF-β1）信号通路来缓解纤维化。β-CD的最大内径为7.8 Å，而PFD中芳香环的宽度约为6.2 Å，因此环脂可以通过主-客体相互作用负载PFD，作者通过1H NMR、2D NOESY NMR、静电势图谱（ESP）和等温滴定量热法（ITC）证明了PFD的有效包封。得益于这一相互作用，CNPs对PFD的封装效率显著高于LNPs，且在药物释放更缓慢。经鼻给药后，CNPs@PFD在肺部的保留率远超游离PFD和LNPs@PFD，且肝脏积累极低，具有优异的肺靶向性与稳定性。如图4所示。

图4. β-CD通过主-客体相互作用包封PFD

    作者又通过多维度实验验证了CNPs在RNA递送与肺纤维化协同治疗中的高效性。CNPs通过高密度离子化头部静电作用稳定结合siRNA，细胞摄取率与LNPs相当，并且在24小时内实现高效内体逃逸。抗纤维化方面， CNPs@siHsp47/PFD可明显抑制Hsp47 mRNA和蛋白的表达，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）等其他纤维化相关蛋白表达水平显著降低，成纤维细胞迁移率也明显降低。与静脉注射相比，经鼻吸入给药可以实现更好的肺部富集， 而30小时后，CNPs在肺部的保留显著优于LNPs。如图5所示。

图5. CNPs@siHsp47/PFD协同治疗肺纤维化

    为了进一步提高CNPs的肺部递送效率，作者通过不同的涡流时间合成了三种不同尺寸的纳米颗粒，通过调整N/P比调控CNPs的ζ电位。将这12种CNPs注射到小鼠体内，发现300 nm左右的NPs有利于肺部靶向递送，主要是肺上皮细胞被转染，其次是免疫细胞和内皮细胞。作者又利用粘蛋白和海藻酸盐模拟气道粘液屏障，测量CNPs的穿透深度，结果发现大尺寸的CNPs穿过粘液屏障的能力更强，这可能是因为小尺寸的纳米颗粒倾向于通过小口径的通道扩散，会有更多的弯曲和死角，而较大的纳米颗粒可以直接通过更宽的通道实现渗透。如图6所示。

图6. CNPs的尺寸与ζ电位优化

    最后作者通过博来霉素（BLM）诱导的小鼠肺纤维化模型评价了CNPs@siHsp47/PFD的协同治疗效果。结果显示，小鼠体重在治疗后期显著恢复，且肺部出血性坏死明显减轻，Hsp47、α-SMA及Col1A1的表达水平显著降低，肺泡增厚和间质水肿得到有效缓解，纤维化面积、Ashcroft评分、肺组织羟脯氨酸、肺系数下降，接近健康鼠。如图7所示。

图7. 小鼠肺纤维化模型中CNPs@siHsp47/PFD的治疗效果

    综上所述，本文合成了一种具有锥形腔、可电离头部和疏水尾部的新型拓扑工程化环脂，能够促进纳米颗粒实现快速的内质网逃逸，同时保持生理稳定性，实现siRNA和药物的高效共递送。添加PEG-Lipid后形成二元环脂纳米颗粒（CNPs），为吸入式给药提供了一个强大的平台，克服了传统LNPs的局限性，具有广阔的临床应用前景。

作者：YXM 

DOI: 10.1021/jacs.5c03033

Link:https://pubs.acs.org/10.1021/jacs.5c03033