今天和大家分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed上的文章，题目是“Secondary Amino Alcohols: Traceless Cleavable Linkers for Use inAffinity Capture and Release”，通讯作者是麻省理工学院化学系B.L.Pentelute教授

背景介绍

肽的捕获和释放是发现具有新功能物质的关键步骤。然而，一般来讲，有效捕获的最佳方法同时会阻碍肽的轻松释放。目前广泛采用的链霉亲和素-生物素亲和捕获和释放受到了这种限制（图1a）。为了释放生物素捕获的肽，需要变性条件（例如在十二烷基硫酸钠（SDS）缓冲液中煮沸），这可能导致多肽降解和污染。因此，需要一种新的方法来有效地回收链霉亲和素捕获的多肽。

可切割linkers是一种很有吸引力的工具，可以在亲和捕获后释放多肽。linkers由化学小分子组成，这些化学小分子可以1）并入肽中，2）在特定条件下裂解。

基于邻二醇的linkers适合标准的固相肽合成（SPPS）操作（Scheme 1b）。1,2-二醇在碱性和酸性条件下稳定，用高碘酸钠可以裂解。这些氧化条件不会破坏折叠蛋白和细胞。

Figure 1

{attr}3229{/attr}醇被高碘酸钠裂解的速度比二醇快1000倍。本文报道了一种基于这种结构的SPPS兼容linker。然而，这种linker需要九步合成，因此对其广泛适用性提出了挑战。

     本文作者报道了将仲氨基醇作为一类新的可氧化裂解的Linker。在小分子研究中，仲氨基醇对NaIO4的氧化反应活性与伯氨基醇相同。

作者基于丝氨酸（seramox）和异丝氨酸（isoseramox）设计了两个linker。在SPPS过程中，这两个Linker可以通过还原胺化插入到肽主链中。两个Linker在数分钟内可被高碘酸盐定量快速裂解（Scheme 1c）。

Scheme  1

异丝氨酸Linker在裂解时释放出一个N端游离的多肽，这是第一个无痕高碘酸盐可切割Linker的例子。异丝氨酸Linker被引入到一个216个成员的肽库中，显示出对合成和裂解的广泛的底物耐受性。异丝氨酸Linker也与细胞实验条件兼容。在高碘酸盐捕获并选择性释放前，一种含有异丝氨酸的细胞穿透肽可以进入细胞胞浆。因此，二级氨基醇Linker使需要捕获和释放合成肽成为可能。

结果与讨论

 在固相合成过程中，仲氨基醇可以被引入肽链中。（Scheme 1a）。二级氨基醇结构与Gly-Ser二肽类似，Gly-Ser其中一个羰基被亚甲基取代，这种官能团被认为是酰胺的生物电子等排体。含丝氨酸Linker的肽在5分钟内被定量裂解，这比相应的含二醇的肽要快（图2）。在相同裂解条件下，二醇4a在60分钟后不到30% 被裂解。而含有丝氨酸Linker的多肽4b的血清在5分钟后被裂解为完全转化。

含seramox结构的多肽裂解产生N-末端为醛的多肽产物（Scheme 1b）。然而，醛类化合物会抑制MS信号，特别是阻碍MS/MS测序。这个问题不仅存在于seramox，也存在于已知的二醇和氨基醇连接物。

而基于异丝氨酸的二级氨基醇Linker（isoseramox）使N-末端游离多肽的无迹释放成为可能。用高碘酸盐裂解isoseramox得到N端为胺的多肽而不是醛类，克服了已知Linker的质谱测序挑战。此外，由于含isoseramox的多肽更易于释放，应用将会更广泛。

用固相合成方法将Isoseramox连接体整合到肽中。异丝氨酸衍生醛（8）分三步合成。肽9（LAGV）上的还原胺化获得含Isoseramox的肽4c（Scheme2b）。NaIO₄在5min内将含有Isoseramox-的肽4c的定量转化为N端游离的肽5c（图2）。尽管从一级醇（seramox）变为一级位阻二级醇（Isoseramox），反应时间不受影响。

Scheme 2

    isoseramox具有广泛的底物耐受性。作者将isoseramox整合到一个组合肽库中来测试1）它对几个N-末端残基的添加效率和2）对不同氨基酸侧链氧化裂解的耐受性。作者合成了216个成员的组合肽库。

肽库包含17个典型氨基酸，分布在8个位置（1234LAYK），其中4个位置可变（图3）。位置1可以是Asp、Met、His、Trp、Tyr、Val、Lys或Gln（包含碱性、酸性、酰胺基、芳香族和脂肪族残基）；位置2可以是Ser、Ala或Leu；位置3可以是Glu、Asn或Gly，位置4可以是Phe、Pro和Thr。

Figure 3

肽库被分为两个部分：第一部分裂解后作为参考肽库library A。第二部分用isoseramox烷基化，然后生物素化（library B）。将肽库B固定在磁性链霉亲和素微球上，用微固相萃取法对肽库B进行脱盐，并在光谱仪上进行纳米LC-MS/MS分析。使用测序软件PEAKS 8.5分析MS/MS光谱，并对获得的完整序列列表进行额外过滤，以获得符合库设计的肽（正确的长度和位置1、2、3和4处的正确单体）。

实验结果表明，从参考库a和肽库B鉴定的序列几乎相同：分别鉴定出90%（216个中的194个）和94%（216个中的2024个）。所有8个可能残基都在1位的序列被鉴定出来。这证明了isoseramox的合成和裂解是有效的。

在研究了短肽条件下的（iso）seramox后，作者用SPPS法合成了Z33蛋白（Z33含有一个33个氨基酸的a螺旋），用圆二色谱法（CD）证实了Z33的α-螺旋结构。用4mM高碘酸钠处理Z33（即比最苛刻的裂解条件浓缩4倍）30分钟后，CD光谱没有显示任何变化。这一结果表明，高碘酸盐处理不会破坏a螺旋结构。

用链霉亲和素捕获生物素化肽后，目前很难将肽释放出来进行分析。比较常用的破坏生物素-链霉亲和素相互作用的方法是在含有SDS的缓冲液中加热复合物。作者将此策略与基于（iso）seramox的肽释放工作进行了比较。制备了两组肽，10a-c和12a-c。其中10a-c肽的C端含有 seramox-Lys (biotin)，12a-c肽的C端含有（Gly-Ser-Lys(biotin)。实验结果显示，基于(Iso）seramoxd策略的从链霉亲和素珠中释放生物素化肽比SDS变性策略更有效（图4）。

Figure  4

Isoseramoxlinker也与细胞的分析条件兼容。在筛选与整个细胞结合的肽或细胞穿透肽（CPPs）时，通常需要从细胞中释放命中的肽。在这里，作者证实了isoseramox Linker可以用来从HeLa细胞中回收CPP。

作者合成了已知的CPP D-穿膜肽的变体（13，图5a）。含isoseramox的CPP保持了其细胞穿透活性（图5b）。含TAMRA（15）的衍生物与HeLa细胞孵育后细胞共聚焦成像显示胞浆和细胞核内有弥漫性荧光。这些实验表明，Linker不会破坏肽的细胞穿透活性和进入胞浆。

Figure  5

结  论

作者阐述了仲氨基醇作为一类新的可裂解Linker。（Iso）seramox在肽库筛选方面具有广泛的适用性。在树脂上合成过程中，（Iso）seramox linkers可以被接入肽中。这些仲氨基醇的裂解速度比已知的二醇linker快。此外，isoseramox是无痕、高碘酸盐标签连接剂的第一个例子，裂解后释放出N-端游离的多肽。

在肽库的合成、捕获和释放过程中，证明了isoseramox具有广泛的底物相容性。此外，isoseramox有助于肽进入细胞后的释放。

作者认为，isoseramox不仅在发现功能性肽和拟肽组分方面有好的效果，而且在小分子和聚合物应用中也将是有价值的工具。

文献整理：Linhao

原文链接：doi.org/10.1002/anie.202003478