Nature Chemical Biology//通过基于活性的蛋白质图谱发现小分子酶激活剂

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跟大家分享一篇今年6月份发表在Nature Chemical Biology的文章,文章的题目是:Discovery of small-molecule enzyme activators byactivity-based protein profiling(通过基于活性的蛋白质图谱发现小分子酶激活剂)。文章的通讯作者是Enrique Saez教授和Dale L. Boger教授。Enrique Saez教授分别于普林斯顿大学和哈佛大学获得学士和博士学位,目前担任斯克里普斯研究所助理教授,主要研究方向是:作为营养传感器的核受体和能量储存的遗传调节。Dale L. Boger教授分别于堪萨斯大学和哈佛大学获得学士和博士学位,目前担任斯克里普斯研究所教授,主要研究方向是:生物活性天然产物的全合成、新合成方法的开发、杂环化学、生物有机和药物化学、组合化学和DNA-试剂相互作用的研究以及抗肿瘤抗生素的化学。

    研究背景:丝氨酸水解酶是哺乳动物中多样化的酶类之一,在许多生物过程中发挥着重要作用。目前,约有一半的丝氨酸水解酶的功能和底物还没有被发现,溶血磷脂类酶1LYPLAL1)就是其中一个例子。LYPLAL1与人类代谢疾病(包括肥胖、2型糖尿病、高密度脂蛋白胆固醇水平和非酒精性脂肪肝等)密切相关。ABPP是一种基于与活性位点可共价结合的小分子探针直接研究酶功能状态的蛋白质组学策略。竞争性ABPP已被用于鉴定酶抑制剂,并且适用于通过荧光偏振监测酶-探针相互作用的高通量筛选。研究发现利用ABPP发展的LYPLAL1抑制剂很可能对治疗代谢疾病是有害的,同时提示增加LYPLAL1的表达,或者通过药物提高LYPLAL1的活性,可能有利于影响葡萄糖的产生和改善代谢功能障碍。目前,开发了许多选择性试剂来辅助丝氨酸水解酶的功能表征。作者推想ABPP的多功能性也可能实现小分子酶激活剂鉴定,本文就利用ABPPLYPLAL1酶的激活剂进行了鉴定。

作者利用了2006Cravatt 组发展的基于ABPP的荧光偏振分析技术和纯化的mLYPLAL1筛选了16000个小分子库(在这个实验中,罗丹明标记的氟磷酸酯(FP)探针与LYPLAL1反应导致依赖于时间的荧光偏振信号的增加,这反映了通过FP探针与LYPLAL1中催化中心丝氨酸共价结合所测量的酶活性)。实验发现很多小分子荧光极化降低,说明这些小分子可能是LYPLAL1的抑制剂;同时还有许多其他化合物增强了荧光偏振信号,它们可能作为功能获得性配体或激活剂。作者选择了一些化合物并利用胶图进行验证,发现其中有些化合物增加了LYPLAL1ABPP信号强度,证实了它们能够增强FP -罗丹明与酶活性位点的反应能力。进一步作者将这些LYPLAL1激活剂中信号最优的一种用于更广泛的表征。

   

    1.Activity-based protein profiling ABPP)方法 ( FP-罗丹明探针作用实验示意图)

研究内容:之前筛选文库的化合物结构与公司购买的化合物结构在光谱和色谱上相同。当研究人员合成时,发现了异构结构4,这表明在商业筛选中有许多相关化合物可能被类似地错误识别。本文,作者选用自己合成的4进行接下来的实验研究。


2.LYPLAL1小分子激活剂(PAL-4)的合成

将纯化的小鼠(a)或人(bLYPLAL1蛋白与浓度递增的探针4孵育,然后用罗丹明-氟磷酸酯和基于凝胶的ABPP分析进行标记,发现基于凝胶的ABPP的纯酶的分析中观察到活性的增加,PAL-4 (溶血磷脂类酶1 LYPLAL1-4 的药理学激活剂)产生了浓度依赖的约2.5倍和2.3倍增强,这表明4的直接结合使LYPLAL1活性增强。

3. 纯化的小鼠(a)或人(b)的LYPLAL1蛋白与不同浓度的t探针4孵育的凝胶分析图

mLYPLAL1与探针4、罗格列酮(阴性对照)或带有生物素的氟磷酸酯(共价)孵育,反应一半体积通过凝胶过滤柱,然后用FP-若丹明标记并进行基于凝胶的ABPP分析。4处理的凝胶过滤样品中添加的罗丹明-氟磷酸酯标记损失表明4是可逆活化剂。

4. mLYPLAL1与其他探针的作用效果对比图

有研究证明,LYPLAL14-硝基苯乙酸酯(PNPA)有水解作用。为了验证4提高了LYPLAL1催化活性,而不是促进FP探针的反应性,作者测试了4LYPLAL14-硝基苯乙酸酯(PNPA)作用的影响。410μM)处理肝癌细胞裂解液后,用带炔基的FP探针孵育并基于MS的蛋白质组学分析,发现LYPLAL1活性显着增加,而在这些实验中定量的其他49个丝氨酸水解酶则不受影响。综上所述, PAL-4LYPLAL1的有效的、选择性的、可逆的激活剂。

5.化合物4选择性激活内源性LYPLAL1

    探针4的发现代表首次用ABPP检测到小分子激活酶,是小分子诱导的丝氨酸水解酶的酶活性增强的第一个例子,通过ABPP继续探究化合物4的相关性质。发现:(1)接头中的硫原子是必需的;(2)苯基同样是活性所必需的;(3)并非所有密切相关的硫代苯甲基取代基都传递活性;(4)苯甲基上的4-氯取代基活性最强且最有效等。

6. 结构-活性研究

纯酶得到验证后,作者将探针4用于蛋白组研究中。用不同的化合物分别作用于复杂的蛋白组中,发现在复杂蛋白质组中比用纯化酶测试时更有效地增强LYPLAL1活性,且10-14显示出比4更大的激活作用;挑选激活作用较明显的化合物124进行对比,发现12与纯化的LYPLAL1的相互作用亲和力大于4;重组mLYPLAL1412一起孵育会降低酶的热稳定性。用12处理细胞裂解液后,用带炔基的FP探针孵育并基于MS的蛋白质组学分析,发现LYPLAL1活性显着增加,而这些实验中定量的其他丝氨酸水解酶则不受影响。

作者紧接着对LYPLAL1的药理激活模式进行研究,LYPLAL1突变体在人胚胎肾细胞中表达,收集其蛋白质组、孵育,其中对照组为空白,实验组为12孵育,然后再进行基于凝胶的ABPP分析实验。结构模拟结合位点突变、生化和生物物理分析表明,12和其他活化剂可能通过改变催化三联体(Ser124Asp179His211)的氢键网络来实现变构调节,增加LYPLAL1的活性,这和Arg80突变体的作用是一致的。

       7. 关键的非催化残基调节LyPLAL1活性和药理学活化剂功效

接下来,对化合物12进行体内实验的探究,并发现12可增强LYPLAL1在体内的活性。给小鼠服用12C11(一种有效的共价LYPLAL1抑制剂)后,向所有小鼠注射LYPLAL1的炔烃探针,通过基于凝胶的ABPP进行分析发现,与酶有共价作用的C11将不会再标记到酶,而12可增强LYPLAL1在体内的活性。  

8. 化合物12增强体内LYPLAL1活性谱图

最后,小鼠腹腔分别给药(注射12),发现其空腹血糖降低,葡萄糖耐量提高,胰岛素敏感性提高,肝损害标志物的血浆水平升高等现象。12和抑制剂C11双重给药消除了12对葡萄糖稳态和胰岛素敏感性的作用,表明LYPLAL1活性是12体内作用所必需的。

本文证明了可利用竞争性ABPP来鉴定和优化溶血磷脂类酶1LYPLAL1)的小分子激活剂,以表征该酶并阐明其与代谢性状的联系;表明了ABPP可以用于寻找丝氨酸水解酶功能的药理激活剂,从而建立了新的调控模式,为开发小分子激活剂提供了理论依据;说明了关键的非催化残基在驱动小分子和突变诱导的LYPLAL1活化中的静电作用的核心作用;LYPLAL1激活剂可能在代谢紊乱的治疗中有重要作用,在体内阻断LYPLAL1可能会对葡萄糖稳态产生负面影响;这些化学工具和化学方法将有助于其他酶的功能研究和药理验证。

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