on style="white-space: normal; text-indent: 2em;">分享一篇发表在Journal of Biological Chemistry上的文章：Identification of small molecule allosteric modulatorsthat act as enhancers/disrupters of rhodopsin oligomerization。本文的通讯作者有两位，其中一位是来自犹他大学神经生物学系的助理教授Frans Vinberg，他主要研究视黄醛的病理和生理学问题以及感光细胞中的钙信号调控。另一位Krzysztof Palczewski教授来自UC Irvine，主要研究视杆细胞、视锥细胞中视紫红质感光机制和下游信号转导的调控。本文中，作者对50000个小分子进行高通量筛选（HTS），并发展了新的实验方法检测视紫红质的二聚现象，最后发现了9种可以通过别构调节促进/抑制视紫红质二聚的小分子。
视杆细胞中的视紫红质在视觉产生中发挥了重要作用，与大多数GPCR类似，视紫红质也有发生多聚的倾向。GPCR多聚效应被广泛认为对其结构、功能和药理学性质存在影响，以高时空分辨率精确调控着下游信号转导，然而，视紫红质多聚的生物效应尚未研究明确。一些可以影响GPCR多聚的化学小分子或许可以帮助我们认识这些多聚体的生物学和化学性质。本文中，作者在异质表达系统中对小分子进行高通量筛选，接下来在原始的视蛋白上表征HTS得到的分子的生物化学和电生理性质，最后进行一系列药物实验。首先，作者获取了包含50000个小分子的ON L0S1J0库，通过HTS在U2OS视蛋白/β-gal亚基（acceptor-EA与donor-PK二者之一）融合蛋白稳转系上筛选库中靶向视紫红质二聚的小分子。当视紫红质发生自缔合时，互补的β-gal亚基结合，在β-gal底物存在时报告化学荧光信号。同时，作者还利用Venus和RLuc设计了与之平行的另一组BRET筛选实验。初筛时，作者获得了246个阻断剂小分子和108个促进剂小分子。
接下来，作者以EC50≤30 μM作为cutoff，在初筛结果中进一步挑选了24个阻断剂分子和12个促进剂分子。接下来，作者以早先设计的正交BRET实验进行确认，最终的筛选结果包括5个阻断剂分子和4个促进剂分子。这些分子的细胞毒性均较低，也没有影响β-gal本身的活性。在筛选过程中，作者意外发现化合物4在β-gal实验中抑制了视紫红质二聚，而在BRET实验中促进了二聚。
随后，作者测定了加入阻断剂/促进剂小分子后，异视紫红质（全顺式视黄醛）的{attr}3139{/attr}吸收谱与DMSO对照组相比几乎无变化，说明这些小分子没有影响视紫红质本身基态到meta II中间态的跃迁。但这些小分子影响了光照激发后的生色团释放，作者推测这些小分子可能与关键生色残基Trp265之间存在π-π相互作用或存在空间异构结合影响meta II中间态回到基态的速率。之后，作者通过ex vivo ERG（视网膜电图）实验测定了代表性阻断剂分子化合物7和代表性促进剂分子化合物1对视杆细胞光响应灵敏度和动力学的影响，发现化合物7显著影响了光响应动力学性质，化合物1导致了视杆细胞光灵敏度的下降。
总而言之，本文作者通过β-gal和BRET策略筛选小分子库，得到了9个对视紫红质二聚具有促进/抑制作用的小分子。作者通过光谱和动力学性质测定推测这些小分子可能与关键生色残基Trp265之间存在π-π相互作用或存在空间异构结合影响meta II中间态回到基态的速率发挥作用。然而作者也发现他们筛选得到的小分子在in vivo实验中效果不及预期明显，同时由于二聚的视紫红质在视网膜中广泛存在，实验需要的小分子浓度在μM级，可能会对本征生理活动产生干扰。
本文作者：ZSR
责任编辑：LDY
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jbc.2021.101401
文章引用：DOI：10.1016/j.jbc.2021.101401
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