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摘要： Pull-down实验是验证蛋白-蛋白相互作用、小分子-靶蛋白结合的核心技术。生物素-链霉亲和素磁珠体系大幅提升了Pull-down的富集效率与洗涤便利性。本文分享优化实验方案和常见问题解决经验。
一、为什么用磁珠代替琼脂糖珠？
| 对比维度 | 琼脂糖珠（Sepharose） | 链霉亲和素磁珠（SA Beads） |
|---|---|---|
| 操作方式 | 离心分离 | 磁力架分离，更快 |
| 批间一致性 | 离心参数影响回收率 | 磁性分离重复性好 |
| 非特异性结合 | 较高（大孔道物理吸附） | 低（可通过BSA封闭优化） |
| 洗涤步骤 | 离心+弃上清，耗时 | 磁力+吸弃，可高通量 |
| 结合容量 | 高（珠体大） | 通常较低，但够用 |
| 兼容高盐/洗涤剂 | 是 | 是 |
二、Pull-down实验设计
2.1 实验目标分类
| 目标 | 探针设计 | 对照设计 |
|---|---|---|
| 验证已知蛋白互作 | 生物素化"诱饵"蛋白A | 生物素化无关蛋白（阴性对照） |
| 钓取小分子靶蛋白 | 生物素-linker-小分子（化学探针） | 游离小分子竞争置换实验 |
| 验证RNA结合蛋白 | 生物素化RNA序列 | 生物素化随机序列 |
2.2 竞争置换对照（critical!）
单独Pull-down只能证明结合，不能排除非特异性结合。必须设置竞争置换实验：
竞争组条带显著减弱，才能证明结合的特异性。
三、操作SOP（以小分子靶蛋白鉴定为例）
步骤1：探针准备
取生物素-linker-小分子探针，溶于DMSO至1 mM（储液）
使用前1:100稀释至裂解液中（终浓度10 μM，DMSO终浓度≤1%）
步骤2：细胞裂解
推荐裂解缓冲液（IP Lysis Buffer）：
50 mM Tris-HCl pH 7.4
150 mM NaCl
0.5% NP-40
1× Protease Inhibitor Cocktail
1 mM PMSF
避免使用SDS裂解（会破坏蛋白互作）；NP-40浓度不超过1%。
操作：
4°C冰上裂解30 min，每10 min涡旋一次
12,000 rpm离心15 min，取上清（总蛋白裂解液）
BCA法测定蛋白浓度，调至1~5 mg/mL
步骤3：探针与蛋白孵育
取200500 μg总蛋白（300500 μL体积）
加入探针至终浓度10~50 μM
4°C旋转孵育2~4 h（或过夜）
步骤4：SA磁珠封闭与加入
取20~30 μL SA磁珠，用PBS洗3次
加入1% BSA，4°C封闭1 h（减少非特异性结合）
PBS再洗2次后，将封闭好的磁珠加入步骤3样本中
4°C旋转孵育1~2 h
步骤5：洗涤
洗涤方案（4°C，磁力架）：
| 次数 | 洗涤液 | 目的 |
|---|---|---|
| 1次 | IP Lysis Buffer | 去除大部分非特异结合 |
| 2次 | 500 mM NaCl + 0.1% NP-40 | 高盐洗涤 |
| 1次 | PBS | 去除洗涤剂 |
洗涤次数与盐浓度需根据目标蛋白结合强度调整，过度洗涤可能导致弱相互作用蛋白丢失。
步骤6：洗脱与检测
洗脱方案：
SDS上样缓冲液加热（95°C，5 min）： 用于WB鉴定
8 M 尿素洗脱： 用于质谱鉴定（非变性条件富集蛋白后变性洗脱）
游离生物素竞争洗脱（2 mM生物素）： 温和，保留蛋白活性
四、质谱鉴定常见注意事项
背景蛋白去除： 高丰度蛋白（如肌动蛋白、热休克蛋白）常见于磁珠非特异结合，需通过竞争置换对照排除
样本准备： 推荐在胰蛋白酶酶切前进行S-trap/Filter-aided（FASP）纯化
数据分析： 以竞争组与实验组肽段丰度比筛选候选靶蛋白（通常竞争组/实验组 < 0.3为候选）
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