今天为大家分享一篇最近发表在JACS上的文章，Protein−Protein Cross-Coupling via Palladium−Protein Oxidative Addition Complexes from Cysteine Residues。这篇文章的通讯作者是麻省理工学院的Stephen L. Buchwald教授和Bradley L. Pentelute教授。

能够作用于蛋白质的生物偶联技术是非常重要的。目前，除了酶技术以外，蛋白质位点特异性的化学修饰通常采用以下方法，即首先在多肽链中插入一个侧链具有独特反应性的非天然氨基酸或者直接利用低丰度的活性天然氨基酸作为活性位点，随后通过对相应侧基进行位点特异的偶联以实现蛋白质的修饰。在前一种策略中，最常见的方法就是通过Click反应将修饰物与插入蛋白中的非天然氨基酸侧基连接起来，此法适用范围广泛，使大分子或小分子都能特异性的结合到蛋白质上；而后一种策略则利用了低丰度天然氨基酸残基较强的反应活性以及在蛋白质中位点的特异性，相对增强了修饰试剂的化学选择效果，避免了插入非天然氨基酸带来的不利因素。半胱氨酸具有独特反应活性，同时丰度又较低，是对天然氨基酸进行有效修饰的首选。本文作者利用蛋白上的半胱氨酸残基与钯配合物形成钯-蛋白复合物，该复合物可以实现含有半胱氨酸残基的蛋白质之间的交叉偶联。

在传统的钯催化的偶联反应中（图1A），需要有一个芳基卤化物底物(Ⅲ)与零价钯(Ⅱ)发生氧化加成反应得到氧化加成复合物(Ⅳ)。该亲电中间体可以被亲核试剂捕捉，然后通过还原消除反应实现亲核试剂与底物的偶联。但是，如果底物是蛋白质的话，往往需要大大过量的钯试剂(50 eq.)和亲核试剂(500 eq.)来捕捉钯-蛋白复合物中间体。因此作者设想，利用1,4-二卤代芳烃与钯形成的氧化加成复合物与半胱氨酸残基反应，再进行分子内氧化加成预先合成钯-蛋白氧化加成复合物（图1B），然后再将其与亲核性物种直接发生反应偶联（图1C），这样便可以有效提高偶联反应的效率。在之前的研究中，作者已经报道了可以从小分子获得稳定的钯氧化加成复合物用于肽和蛋白质的半胱氨酸残基的交叉偶联。但是对于蛋白质来说，它需要在水溶液中才能稳定存在，这与传统制备钯氧化加成复合物时用到的有机溶剂不相容，因此该反应仍需要进一步改进。

图1. 一种从半胱氨酸残基生成钯-蛋白氧化加成复合物的方法及其在蛋白质交叉偶联中的应用

作者用模型多肽Z33作为底物进行了反应的优化，在这个多肽链中只引入了一个半胱氨酸残基（图2）。作者预期会有两种可能的反应途径：成功进行分子内氧化加成生成化合物4或者钯分解生成化合物5。通过改变配体、改变卤素原子、改变溶剂添加剂以及底物浓度，最终作者发现在10 μM的底物浓度下，使用试剂L3-Pd-I以及添加5%的DMF可以得到较高的转化率和较高的产物比(4 : 5)，并且不会产生沉淀(Entry 9)。在这个反应中钯试剂采用10当量，这是为了降低底物之间直接发生二聚的可能性。

图2. 合成钯-蛋白氧化加成复合物的条件筛选

进一步，作者将多肽底物换成了仅含一个半胱氨酸残基的蛋白质，选用的蛋白质有炭疽保护抗原的半胱氨酸变体(mPA, 83 kDa)，T4 溶菌酶(19kDa)，SUMO-DARPin (27 kDa)。LC-MS分析产物显示，这些蛋白质都能以较高的转化率生成钯-蛋白氧化加成复合物。并且作者发现，Pd-mPA氧化加成复合物可以在缓冲液中保存一天，反应活性不会下降。

接下去，作者选用了大分子量的Pd-mPA复合物来研究蛋白偶联的反应性。在将mPA转化为相应的钯氧化加成复合物后，作者用镍柱和SEC对其进行了纯化。作者继续选用天然蛋白质中的半胱氨酸残基进行蛋白质交叉偶联，利用SDS-PAGE评估了反应转化率，转化率为57%-79%（图3）。

与另一种获取蛋白-蛋白偶联物的方法——基因表达相比，利用本文中提到的方法，单独折叠的蛋白之间可以直接通过侧链半胱氨酸残基偶联得到蛋白质偶联物，不需要对共表达蛋白的母质粒进行重新设计，从而在一定程度上降低了获得蛋白-蛋白偶联物的技术难度。

图3. 蛋白质的交叉偶联反应

总之，作者报道了一种在水相条件下，通过钯-转移策略在含有半胱氨酸残基的蛋白底物上合成稳定的钯-蛋白氧化加成复合物的方法，可以有效实现半胱氨酸残基侧链的蛋白交叉偶联。这种策略在合成抗体-药物偶联物和抗体-蛋白偶联物的领域中具有广阔的应用前景。

DOI: 10.1021/jacs.0c03143

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c03143